多重PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用與展望

董蕾　黃曉波　劉靜璇

摘要 多重PCR技術(shù)建立在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，作為一種高效、快速、高靈敏性及特異性的方法，其被應(yīng)用在食品檢測的各個領(lǐng)域。從食品安全檢測角度，簡要論述多重PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和弓形菌等食源性致病菌檢測中的應(yīng)用，并根據(jù)長期工作總結(jié)多重PCR技術(shù)操作的重難點和前景展望，以期為多重PCR技術(shù)在食品檢測中的工作提供幫助。

關(guān)鍵詞 多重PCR;食品致病菌;檢測

中圖分類號 TS207.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2020）11-0015-04

AbstractMultiplex PCR which is based on conventional PCR is an efficient， fast， sensitive and specific method for food detection. In this paper， the application of multiplex PCR in detection of foodborne pathogenic bacteria such as Escherichia coli， Staphlococcus aureus and Arcobacter， etc. was discussed to provide support for the work of multiplex PCR technology in food detection.

Key words Multiplex PCR;Food pathogenic bateria;Detection

自1988年Chamberlain等[1]首次提出多重PCR技術(shù)（multiplex polymerase chain reaction，MPCR），并利用該技術(shù)進(jìn)行杜氏營養(yǎng)不良癥（Duchenne musculardystrophy）基因外顯子缺失的檢測以來，多重PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)（包括遺傳病診斷、病原體檢測等）、食品科學(xué)（食品原料溯源、食品病原微生物檢測等）等科學(xué)領(lǐng)域均有極大貢獻(xiàn)，成為檢測的一項重要技術(shù)工具。筆者從食品安全檢測角度，簡要論述多重PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和弓形菌等食源性致病菌檢測中的應(yīng)用，并根據(jù)長期工作總結(jié)多重PCR技術(shù)操作的重難點和前景展望，以期為多重PCR技術(shù)在食品檢測中的工作提供幫助。

1 多重PCR技術(shù)簡介

多重PCR技術(shù)又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR技術(shù)，是一種建立在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，并進(jìn)行改進(jìn)的新型PCR技術(shù)。不同于常規(guī)PCR的單一引物擴增，在多重PCR體系中同時加入多對引物進(jìn)行多目標(biāo)DNA片段擴增[2]，由于目標(biāo)片段大小不同，經(jīng)由多重PCR擴增后，凝膠成像即可直接進(jìn)行分析[3]。該方法相比常規(guī)PCR方法，因其在同一體系中同時進(jìn)行多目標(biāo)DNA片段的擴增，從而達(dá)到節(jié)約模板DNA、節(jié)省時間和成本的優(yōu)勢。

多重PCR技術(shù)建立在常規(guī)PCR技術(shù)之上，利用模板DNA、多對引物、4種脫氧核糖核苷酸，依賴于DNA聚合酶完成酶促合成反應(yīng)。多重PCR技術(shù)具有高效性：在同一反應(yīng)體系、反應(yīng)時間內(nèi)可以同時檢測多種病原菌或目標(biāo)基因;系統(tǒng)性：對于同一食品或癥狀相同的病原菌可以進(jìn)行同時檢測;經(jīng)濟簡便性：由于在同一體系內(nèi)同時反應(yīng)，可大大節(jié)約檢測時間及檢測試劑[4]。

2 多重PCR技術(shù)在食品致病菌檢測中的應(yīng)用

多重PCR技術(shù)在同一體系中加入不同目標(biāo)片段的引物，即可完成在一次反應(yīng)中多個目標(biāo)片段的同時擴增，多重PCR技術(shù)大大提升了檢驗過程的時長、降低了試劑耗材的損耗，使檢驗過程快速簡便，被廣泛應(yīng)用于食品檢驗的各個領(lǐng)域。

2.1 金黃色葡萄球菌的檢測

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，SA）在自然界分布廣泛，是革蘭氏陽性菌的代表，能夠引起人和動物的嚴(yán)重感染發(fā)病，是一種重要的人類病原菌[5-6]。該菌所產(chǎn)生的腸毒素（SE）引起的食物中毒是世界性的衛(wèi)生難題，在美國、加拿大等國家，由于金黃色葡萄球菌引起的食物中毒現(xiàn)象超過30%，中國也時有發(fā)生。近年來利用PCR技術(shù)診斷檢測金黃色葡萄球菌腸毒素，使檢測快速準(zhǔn)確。

楊玉軍等[7]針對金黃色葡萄球菌最常引起食物中毒的4種類別（A、B、C、D型）SE基因保守序列設(shè)計4對引物（表1），對SE片段進(jìn)行擴增，獲得最優(yōu)反應(yīng)體系，總體積為25 μL體系中，各引物濃度為0.2 μmol/L;徐曉可等[8]以耐熱核酸酶基因nuc、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因clfA和SmaI限制性酶切片段特異序列為目標(biāo)片段，設(shè)計引物3對（表1），驗證靈敏度在模板水平上可達(dá)1.197 3 ng;Costa等[9]針對mecA和nuc目標(biāo)片段，設(shè)計熒光定量PCR引物進(jìn)行檢測驗證，效果優(yōu)異（表1）。

2.2 沙門氏菌的檢測

沙門氏菌（Salmonella）是一類革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科，除感染人以外，也會感染哺乳類、鳥類、魚類等，當(dāng)人接觸含這類菌的食物時均會引起食物中毒，出現(xiàn)傷寒、腸胃炎、腸毒癥、敗血癥等腸道疾病。每年全球由于沙門氏菌引發(fā)的食源性疾病均居于食源性疾病病因的前列[10-13]。

邵碧英等[14]根據(jù)沙門氏屬特異基因hut基因、hilA基因、invA基因和hns基因設(shè)計特異性引物，實現(xiàn)沙門氏菌的三重PCR;唐雨德等[15]針對S1、S2、invA基因設(shè)計4對特異性引物，對16株沙門氏菌進(jìn)行PCR檢測，靈敏度平均為100 CFU，人工污染樣品最低檢出限為10 CFU，大大縮短檢驗時間（表2）。

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