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    連作與輪作對溫室土壤中真菌多樣性的影響

    2020-06-21 15:29:57高磊
    南方農(nóng)業(yè)·下旬 2020年3期
    關鍵詞:多樣性真菌

    摘 要 以不同連(輪)作年限種植白肉靈芝的溫室土壤為實驗材料,研究不同連(輪)作年限土壤真菌多樣性的變化趨勢。通過高通量測序技術(shù)并結(jié)合相關生物信息學方法,分析土壤中真菌ITS1+ITS2區(qū)域的豐富度、多樣性指數(shù)以及群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,連作或輪作后均能夠提高微生物群落多樣性,子囊菌門、擔子菌門及接合菌門為優(yōu)勢真菌,擔子菌門的比例隨連作年限的增加而逐漸增加,輪作后豐度降低。

    關鍵詞 白肉靈芝;真菌;多樣性

    中圖分類號:S154.3 文獻標志碼:B DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.093

    土壤中的微生物主要通過吸收和轉(zhuǎn)化的途徑影響?zhàn)B分的利用,而造成土壤營養(yǎng)水平低下及產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量下降的原因則可能是微生物種群發(fā)生了變化[1]。產(chǎn)品連作年限較久會造成土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)單一化,從而造成土壤質(zhì)量直線下降,土壤pH發(fā)生變化甚至于造成產(chǎn)品產(chǎn)量大減或者絕收。而造成產(chǎn)品減產(chǎn)的原因則主要是真菌,如尖孢鐮刀菌、疫霉屬及炭疽菌屬等致病真菌?;诖?,從真菌數(shù)量、種類等方面,研究連作和輪作對土壤中真菌多樣性的影響,為連作障礙提供理論依據(jù)[2-3]。

    1 材料與方法

    1.1 時間與地點

    試驗于2019年3—8月在西藏自治區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)示范園區(qū)溫室大棚進行。

    1.2 試驗材料

    5個相鄰的溫室:1)多年未種植白肉靈芝;2)連作白肉靈芝2年;3)連作白肉靈芝2年后輪作種植羊肚菌;4)連作白肉靈芝3年后輪作種植蒜苗;5)連作白肉靈芝3年后換土。

    試劑盒:E.Z.N.A.?Soil DNA Kit。

    1.3 取樣及保存

    5個溫室分別在白肉靈芝未種植及種植后分時間段采取土壤樣品于-20℃冷凍保存。

    1.4 試驗方法

    1.4.1 土壤微生物基因組DNA的提取

    稱取0.5 g于-20 ℃保存的土壤樣品,按試劑盒的試驗步驟進行微生物總DNA的提取,DNA樣品于-20 ℃保存待用。

    1.4.2 試驗流程

    提取樣品總DNA后,根據(jù)設計得到真菌ITS1+ITS2合成的引物,合并引物接頭,進行PCR擴增。

    PCR反應體系:含15 mmol·L-1 MgCl2的10×Buffer 10.0 μL,2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.0 μL,10 μmol·L-1引物各5.0 μL,5 U·μL-1Taq酶1.0 μL,DNA模板4.0 μL,滅菌去離子水73.0 μL,總體積100 μL。

    PCR反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環(huán);72 ℃ 10 min。

    文庫建立:對產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫,建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢,質(zhì)檢合格的文庫用HiSeq PE250進行檢測,由聯(lián)川生物技術(shù)公司完成測序[4]。

    1.4.3 數(shù)據(jù)處理

    試驗數(shù)據(jù)均采用Excel和SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同連作年限土壤真菌OTU聚類分析

    將所有樣品的有效序列進行聚類,按照97%的序列相似度將這些序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units),得到每個Cluster的序列及其代表序列(即為OTU),用于統(tǒng)計每個OTU序列和豐度進行下游分析[5]。

    由圖1的Venn圖可知,1號溫室總OTUs為448,2號溫室總OTUs為1 390,3號溫室總OTUs為1 211,4號溫室總OTUs為925,5號溫室總OTUs為421;5個樣品中共有的OTUs個數(shù)有143個,其中2號溫室特有OTUs個數(shù)最多,達到240個(因5號溫室置換土壤過程中導致數(shù)據(jù)異常,不再對其進行后續(xù)分析)。

    2.2 不同連作年限土壤真菌Alpha多樣性分析

    Alpha多樣性也稱為生境內(nèi)物種多樣性[6],包括Chao1、Observed_species、Goods_coverage、Shannon和Simpson指數(shù)。利用Alpha多樣性分析方法,對土壤樣品中的OTUs總數(shù)和Chao1指數(shù)進行分析,可得出連作土壤中真菌的多樣性變化及數(shù)值[7]。不同年限連(輪)作下土壤真菌Alpha多樣性的結(jié)果如表1所示。

    由表1可知,在白肉靈芝生長過程中,輪作及連作土壤中真菌的OTUs總數(shù)及Chao1指數(shù)均高于未種植靈芝溫室;連作后輪作的品種對溫室土壤真菌群落OTUs總數(shù)及Chao1指數(shù)有一定的影響。通過Alpha多樣性分析可知,連作與輪作均能夠提高微生物群落多樣性。

    2.3 不同連作年限土壤真菌群落門類組成物種分析

    2.3.1 不同連作年限土壤真菌物種分類統(tǒng)計

    根據(jù)物種豐度表,選取豐度最高的20個物種分類,進行相對豐度計算,獲得相對豐度數(shù)據(jù),繪制樣品豐度柱狀圖,便于更直觀地進行樣品豐度比較[8-9]。圖2和圖3中橫軸為樣品名稱,每個樣品3個重復,縱軸代表門及屬的相對豐度;不同顏色對應不同物種。由圖2門級別柱狀圖可以看出各溫室土壤中占比最高的真菌為子囊門(Ascomycota),其次分別為擔子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota);連作增加了擔子菌門的相對豐度,輪作降低了擔子菌門的相對豐度,卻增加了接合菌門的相對豐度。由圖3屬級別柱狀圖可以看出2、3、4號溫室中內(nèi)生菌屬(Phialocephala)含量較多,1號溫室內(nèi)生菌屬含量較少;木霉屬(Hypocrea)在各溫室土壤中含量較高;煙色織孢霉屬(Plectosphaerella)在2、4號溫室含量較高,1、3號溫室含量較少;透孢黑團殼屬(Massarina)在2、3號溫室含量較高,4號含量較少,1號溫室沒有;靈芝屬(Ganoderma)除了1號溫室沒有外,在2、3、4均有存在。

    3 結(jié)論

    通過微生物測序技術(shù)得出白肉靈芝輪作和連作土壤樣品中真菌的門、屬類別及豐度,發(fā)現(xiàn)連作或輪作后均能夠提高微生物群落多樣性,子囊菌門、擔子菌門及接合菌門為優(yōu)勢真菌,擔子菌門的比例隨連作年限的增加而逐漸增加,輪作后豐度降低,但接合菌門的相對豐度增大。但是仍有很大一部分類別真菌物種尚未鑒定出,尤其是屬級別真菌,所以需要進行進一步的研究探討和鑒定。

    參考文獻:

    [1] 馬琨,張麗,杜茜,等.馬鈴薯連作栽培對土壤微生物群落的影響[J].水土保持學報,2010,24(4):229-233.

    [2] 周陳,李許,楊明開,等.冬小麥不同生育期土壤微生物及養(yǎng)分動態(tài)變化[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2008,17(3):113-116.

    [3] 張重義,林文雄.藥用植物的化感自毒作用與連作障礙[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報,2009,17(1):189-196.

    [4] Bokulich N A,Subramanian S,F(xiàn)aith J J,et al.Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing[J].Nature methods,2013,10(1):57-59.

    [5] Blaxter M,Mann J,Chapman T,et al.Defining operational taxonomic units using DNA barcode data[J].Philosophical transactions of the Royal Society of London,Series B,Biological Sciences,2005,360(1462):1935-1943.

    [6] Sul W J,Cole J R,Jesus E C,et al.Bacterial community comparisons by taxonomy-supervised analysis independent of sequence alignment and clustering[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(38):14637-14642.

    [7] Price M N,Dehal P S,Arkin A P.FastTree 2-Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments[J].Plos One,2010,5(5):e9490.

    [8] Xiong W G,Wang Y L,Sun Y X,et al.Antibiotic-mediated changes in the fecal microbiome of broiler chickens define the incidence of antibiotic resistance genes[J].Microbiome,2018,6:34.

    [9] Ren L L,Zhang R B,Rao J,et al.Transcriptionally Active Lung Microbiome and Its Association with Bacterial Biomass and Host Inflammatory Status[J].mSystems,2018,3(5):e00199-18.

    (責任編輯:趙中正)

    收稿日期:2020-01-15

    基金項目:西藏白肉靈芝連(輪)作下土壤生物相關性研究(XZ2017ZRG-39);國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系拉薩綜合試驗站課題(CARS-20-95);科技富民穩(wěn)邊專項-西藏特色食用菌高效栽培技術(shù)示范課題(XZ201901NA05)。

    作者簡介:高磊(1987—),男,甘肅白銀人,碩士,助理研究員,從事食用菌培養(yǎng)等方向的研究。E-mail: 1173835491@qq.com。

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