康定木蘭花芽分化機(jī)理研究

王曉英 彭克忠 余海清 蘭常軍 劉韓 吳富雨 夏苗 伍杰

摘要? ? 在成都地區(qū)引種栽培的康定木蘭，生長情況良好，但未發(fā)現(xiàn)開花，關(guān)于其花芽分化過程及相關(guān)機(jī)理研究尚不明確。本文以野生康定木蘭花芽、栽培康定木蘭花芽為材料通過石蠟切片觀察康定木蘭花芽分化過程。同時，研究噴施激素和修剪處理對栽培康定木蘭花芽分化的影響，探索康定木蘭花芽分化機(jī)理。結(jié)果表明，野生康定木蘭花芽分化從4月底開始到6月上旬結(jié)束，整個過程歷時39 d左右;康定木蘭的未分化期、花芽分化初期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期分別歷時35、6、10、11、12 d;同時期的栽培康定木蘭在經(jīng)過各種處理后并未進(jìn)行花芽分化。成都平原夏季自然高溫可能抑制康定木蘭花芽分化。

關(guān)鍵詞? ? 康定木蘭;激素;修剪;花芽分化;石蠟切片

中圖分類號? ? Q944.85? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）11-0143-02? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Study? on? Flower? Bud? Differentiation? Mechanism? of? Magnolia? dawsoniana

WANG Xiao-ying? ? PENG Ke-zhong? ? YU Hai-qing? ? LAN Chang-jun? ? LIU Han? ? WU Fu-yu? ? XIA Miao? ? WU Jie *

（Sichuan Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Forestry Research Institute，Kangding Sichuan 626001）

Abstract? ? The growth of Magnolia dawsoniana introduced and cultivated in chengdu Area is good，but no flowers has been found，the study on the process of flower bud differentiation and its related mechanism are still unclear. In this paper，the bud differentiation of wild and cultivated M. dawsoniana was observed by paraffin section.At the same time，the effects of spraying hormone and pruning on flower bud differentiation of cultivated M. dawsoniana were studied to explore the mechanism of flower bud differentiation. The results showed that the flower bud differentiation of wild M. dawsoniana lasted about 39 days from the end of April to the end of early June;the undifferentiated stage，the initial stage of flower bud differentiation，the petal primordium differentiation stage，the stamen primordium differentiation stage and the pistil primordium differentiation stage of M. dawsoniana lasted 35，6，10，11 and 12 days，respectively;the buds of cultivated M. dawsoniana at the same time did not differentiatie after various treatments，the natural high temperature in Chengdu Plain might inhibit the flower bud differentiation of M. dawsoniana.

Key words? ? Magnolia dawsoniana;hormone;prune;flower bud differentiation;paraffin section

康定木蘭（Magnolia dawsoniana）是我國西南山區(qū)特有的一種原始古老孑遺植物，是木蘭屬中較原始的種類，屬國家保護(hù)珍稀樹種。因?yàn)榛ù蠓枷恪⑸势G麗，集觀賞、食用、藥用等用途于一體，具有極高的開發(fā)利用價值[1]。目前，康定木蘭已在成都等地引種，生長狀況良好，但是均未發(fā)現(xiàn)開花;康定木蘭嫁接苗的苗齡最大已經(jīng)達(dá)到4年，仍始終未見花芽分化。這可能與康定木蘭花芽分化期間的成都平原高溫天氣有關(guān)。目前，仍缺少足夠的生物學(xué)和生理學(xué)證據(jù)支持，需要進(jìn)一步深入研究和分析。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

野生康定木蘭來源于四川省甘孜州瀘定縣燕子溝鎮(zhèn)的南門關(guān)溝和雅加埂海拔1 900～2 500 m的原始森林;栽培康定木蘭來源于四川省成都市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地。

1.2? ? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1? ? 野生康定木蘭花芽分化的解剖學(xué)研究。觀察野生康定木蘭的花芽分化進(jìn)程和形態(tài)特征，研究時間為2019年3月下旬至6月下旬，每7 d采集1次選定野生康定木蘭樹冠上部外圍不同方向的頂芽（為2018年開過花的芽）[2]。利用常規(guī)石蠟切片法，進(jìn)行形態(tài)解剖學(xué)的觀察。

1.2.2? ? ?栽培康定木蘭花芽分化的解剖學(xué)研究。

（1）噴施激素對栽培康定木蘭花芽分化的影響。設(shè)10個處理，分別為噴施6-BA濃度為25、50、100 mg/L，噴施ABA的濃度為50、100、200 mg/L和噴施GA的濃度為50、100、200 mg/L，噴施等量清水作對照（CK1）。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個處理重復(fù)3次。每個處理選取長勢相似、大小相近的栽培康定木蘭10株。并于2019年4月葉片展開后進(jìn)行噴施，每7 d噴施1次，連續(xù)噴施3次，每次噴施至滴水狀為止。于2019年4—6月每7 d采集處理后的栽培康定木蘭當(dāng)年生枝條莖尖。采用常規(guī)石蠟切片法觀察經(jīng)噴施激素處理后的栽培康定木蘭花芽分化過程。

（2）修剪對栽培康定木蘭花芽分化的影響。設(shè)3個處理，分別為短截處理、摘心處理、以不做任何處理作對照（CK2）。每個處理選取長勢相似、大小相近的栽培康定木蘭3株，重復(fù)3次。于2019年1月進(jìn)行短截和摘心處理。于2019年4—6月每7 d采集不做處理及處理后的栽培康定木蘭當(dāng)年生枝條莖尖。采用常規(guī)石蠟切片法，觀察經(jīng)修剪處理后的栽培康定木蘭花芽分化過程。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 材料固定與切片制作。在采集康定木蘭頂芽或莖尖之后，立即置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。在體式解剖鏡下剝凈外鱗片及絨毛后，立即放入FAA固定液中保存[3]。采用常規(guī)石蠟切片法將固定下來的試驗(yàn)材料制成永久切片，主要操作步驟如下。

（1）脫水。用濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%酒精從低濃度到高濃度逐級浸泡脫水，各濃度梯度浸泡脫水的時間均為30 min左右。

（2）透明。以TO透明劑作為透明劑，脫水后的材料分別經(jīng)過2/3乙醇+1/3的TO透明劑、1/2乙醇+1/2的TO透明劑的混合液中浸漬30 min，再轉(zhuǎn)入TO透明劑中浸泡60 min至材料透明。

（3）浸蠟。將透明好的材料放入熔化的石蠟（熔點(diǎn)54～56 ℃）和TO透明劑的等量混合液中，蓋上木塞，再移入溫度 60～65 ℃的烘箱中用融化的石蠟液浸漬2 d。

（4）包埋。浸好蠟的材料與石蠟溶液一起迅速倒入預(yù)先折好的包埋盒中，用鑷子將材料扶正以便切片，待表面的蠟?zāi)毯?，立即放入裝有冷水的盆中，使材料迅速冷卻定型。

（5）切片。包埋好的蠟片用刀片修成規(guī)整的梯形，粘于小木塊上，置于切片機(jī)上切片，切片厚度8 μm。

（6）粘片與烤片。用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟片，置于展片臺上鋪展，吸除多余水分，將載玻片放入42 ℃溫箱干燥。

（7）脫蠟及復(fù)水。干燥后的切片放入TO透明劑中脫蠟30 min，依次放入2/3 TO透明劑+1/3酒精、1/2 TO透明劑+1/2酒精、1/3 TO透明劑+2/3酒精中浸泡2 min，再依次放入100%、90%、80%、70%、60%、50%酒精、蒸餾水中浸泡復(fù)水，時間均為5 min。

（8）染色及透明。1%番紅染色劑染色60 min，水洗去除多余染料后再依次放入35%、50%、70%、80%酒精中浸泡5 min，再放入0.5%固綠中浸泡20 s，隨后依次放入100%酒精、1/2酒精+1/2 TO透明劑溶液、TO透明劑溶液中浸泡，浸泡時間依次為3、5、5 min，使切片透明。

（9）封片。把載玻片從TO透明劑中拿出，用濾紙先將TO透明劑吸凈，再滴加2滴中性樹膠于載玻片上，蓋上蓋玻片，進(jìn)行封片。制成永久封片。

1.3.2? ? 切片的觀察。將制作好的石蠟切片放置在顯微鏡下觀察，拍照并保存。根據(jù)照片進(jìn)行分析與統(tǒng)計(jì)，找出每個時期最具代表性的圖片，并且記錄好采樣時間。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 野生康定木蘭的花芽分化

2.1.1? ? 花芽分化進(jìn)程。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，野生康定木蘭自花謝后開始萌芽長出新葉，經(jīng)過近30 d的抽新枝，在新芽的頂端開始出現(xiàn)新芽。在花芽分化過程中，芽外部依次形成2～3層被白色毛的佛焰苞狀苞片。康定木蘭每年只進(jìn)行1次花芽分化，從4月下旬開始頂芽逐步分化，6月上旬分化結(jié)束。以康定木蘭長出新葉時間為0 d（2019年3月28日）統(tǒng)計(jì)花芽分化各階段的天數(shù)，即從當(dāng)前階段開始時間至下一階段開始時間。由表1可知，康定木蘭花芽分化初期歷時最短，為6 d;雌蕊原基分化期持續(xù)時間最長，為12 d;花瓣原基分化期持續(xù)時間、雄蕊原基分化期持續(xù)時間分別為 10、11 d;從花芽分化初期開始至雌蕊原基分化結(jié)束共歷時約39 d。

2.1.2? ? 花芽分化的形態(tài)特點(diǎn)。野生康定木蘭的花芽分化過程可分為以下5個時期。一是未分化期?；ㄑ績?nèi)部生長點(diǎn)體積小，分化原基分生細(xì)胞體積很小，并且排列十分緊密，如圖1（a）所示。二是花芽分化初期?；ㄑ糠只跗谥饕侨~原基的形成期，此時花芽內(nèi)部逐步形成佛焰苞花序，花芽原基處開始出現(xiàn)空腔，分化原基開始突起、變寬、頂部光滑，細(xì)胞排列緊密，如圖1（b）所示。三是花瓣原基分化期?；ㄑ績?nèi)部花原基生長錐伸長變形，內(nèi)側(cè)出現(xiàn)凹陷和突起，花瓣原基開始分化，如圖1（c）所示。四是雄蕊原基分化期。內(nèi)部空間變大，花原基的生長錐伸長變粗，頂端光滑，外緣細(xì)胞小而緊密，內(nèi)部細(xì)胞大而疏松，花瓣原基內(nèi)側(cè)生長錐底部周邊開始出現(xiàn)幾輪突起的小點(diǎn)，即為雄蕊原基，如圖1（d）所示。五是雌蕊原基分化期。內(nèi)部生長錐伸長，底部變粗，頂部光滑，近似圓錐形，生長錐上部出現(xiàn)多輪突起，開始進(jìn)行雌蕊分化，直至分化完成，如圖 1（e）所示。

2.2? ? 栽培康定木蘭的花芽分化

引種栽培康定木蘭芽在經(jīng)過不同濃度的外源激素處理和不同修剪處理后，從各時期采集的栽培康定木蘭腋芽切片情況來看，均未發(fā)現(xiàn)花芽分化現(xiàn)象。栽培康定木蘭芽內(nèi)第2～3層芽鱗狀托葉外面密被白色柔毛，最內(nèi)層1枚包被著雛枝、雛芽、雛葉與雛托葉，如圖1（f）所示。

3? ? 結(jié)論與討論

通過對野生康定木蘭花芽及栽培康定木蘭花芽的切片觀察發(fā)現(xiàn)，野生康定木蘭芽進(jìn)行花芽分化，而同時期的栽培康定木蘭芽在經(jīng)過不同濃度的外源激素處理和修剪處理后并未進(jìn)行花芽分化。野生康定木蘭花芽分化從4月底開始，花瓣原基從5月上旬開始分化，雄蕊原基從5月中旬開始分化，雌蕊原基出現(xiàn)較雄蕊原基稍晚，從5月底開始分化?？刀咎m的未分化期、花芽分化初期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期，分別歷時35、6、10、11、12 d;野生康定木蘭花芽分化從4月底開始，6月上旬結(jié)束，整個花芽分化過程共歷時39 d左右，花芽分化時期接近白玉蘭。栽培康定木蘭芽未進(jìn)行花芽分化，但是形態(tài)特征與玉蘭頂葉芽類似。

目前，康定木蘭成花的機(jī)制研究尚不明確。影響植物花芽分化原因有內(nèi)因和外因，如環(huán)境因子中的溫度與光照。甘孜州屬亞溫帶高原濕潤氣候區(qū)，年平均氣溫7 ℃左右，極端最低溫度-14 ℃，極端最高溫度29 ℃，各地常年日照時數(shù)一般為1 900～2 600 h。成都市屬中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫在16 ℃左右，極端最低氣溫為-5.9 ℃，年平均日照時數(shù)為1 040～1 410 h?？刀咎m花芽分化時期為4—6月，成都?xì)鉁厥冀K高于甘孜，這可能是康定木蘭引種栽培到成都而不能進(jìn)行花芽分化的原因之一。

木蘭花芽分化的過程是多數(shù)基因共同表達(dá)、相互作用的結(jié)果，而且基因主要是在花芽分化的前期發(fā)揮作用，完成成花轉(zhuǎn)變的過程[4-6]。對于引種栽培的康定木蘭來說，與成花途徑相關(guān)基因的調(diào)控也可能影響花芽分化的進(jìn)程。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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作者簡介? ?王曉英（1973-），女，四川康定人，工程師，從事林木育種工作。

通信作者

收稿日期? ?2020-03-08