包載多西他賽的聚合物膠束抑制小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移作用研究

王愛婷 鄢 丹 齊憲榮

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038；2. 臨床合理用藥生物特征譜學(xué)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；3. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院藥劑學(xué)系，北京 100191)

2019年1月，國家癌癥中心發(fā)布的最新一期全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]顯示，乳腺癌為女性發(fā)病首位，每年發(fā)病人數(shù)約為30.4萬，死亡人數(shù)約6.99萬。腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌分期的重要依據(jù)之一，也是影響預(yù)后的主要因素[2-4]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)[5]認(rèn)為，早期乳腺癌可以治愈，但仍有20%～30%的乳腺癌患者發(fā)展至晚期，IV期乳腺癌5年生存率不到20%。因此，研究抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物及其制劑具有重要意義。

目前，腫瘤治療常采用手術(shù)聯(lián)合化學(xué)藥物治療和放射治療的治療方案，但這種方法常伴隨嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且常因腫瘤轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)使得治療效果不佳[6]。納米給藥系統(tǒng)的興起與快速發(fā)展，為腫瘤治療提供了更多選擇。納米給藥系統(tǒng)可通過系統(tǒng)本身的物理化學(xué)性質(zhì)和包載的造影劑或治療藥物發(fā)揮多重的診斷和治療功能：通過實(shí)體瘤的高通透性和滯留(enhanced permeability and retention, EPR)效應(yīng)在腫瘤組織蓄積，即實(shí)現(xiàn)被動靶向功能；亦可通過腫瘤特異性配體修飾實(shí)現(xiàn)主動靶向作用。此外，納米給藥系統(tǒng)可被設(shè)計(jì)為特異性刺激響應(yīng)型，如pH、缺氧、酶等內(nèi)源性刺激響應(yīng)或光、磁場、超聲等物理性刺激響應(yīng)。轉(zhuǎn)移瘤與原位實(shí)體瘤不同的是，轉(zhuǎn)移瘤初始體積微小且相對缺乏血管使得納米給藥系統(tǒng)很難通過EPR效應(yīng)發(fā)揮被動靶向，這給腫瘤轉(zhuǎn)移的治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。然而，不斷地有更多新型納米給藥系統(tǒng)被設(shè)計(jì)用于腫瘤轉(zhuǎn)移的治療[7]。

除腫瘤轉(zhuǎn)移外，腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)也嚴(yán)重影響腫瘤患者的治療效果和預(yù)后。有研究[8]表明，腫瘤多藥耐藥和腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。如與腫瘤多藥耐藥相關(guān)的基因P糖蛋白被發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移腫瘤中高度表達(dá)；MDR相關(guān)蛋白(multidrug resistance related protein, MRP)、CD44的高表達(dá)也與腫瘤表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

本課題組前期構(gòu)建的含TPGS1000的包載多西他賽的聚合物膠束具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用[9-10]。因此，本研究將進(jìn)一步考察該聚合物膠束抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多西他賽(docetaxel, DTX)購自北京諾瑞醫(yī)藥技術(shù)有限公司；甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy(polyethylene-glycol)2000, DSPE-mPEG2000]購自日本油脂株式會社(NOF)；聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS1000)購自美國Sigma-Aldrich公司；泰索帝?(Taxotere?)購自賽諾菲-萬安特(上海)制藥有限公司；0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶、雙抗(含青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L)、RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京中科邁晨科技有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；D-Luciferin購自美國Santa Cruz公司；Bouin’s溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

螢火蟲熒光素酶標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1/Luc)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。培養(yǎng)液為RPMI 1640+10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清+1%(體積分?jǐn)?shù)) 雙抗，培養(yǎng)于37 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2環(huán)境中，消化液為0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶+0.02% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))EDTA。雌性Balb/c小白鼠，體質(zhì)量15～16 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物部飼養(yǎng)。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照北京大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.2 聚合物膠束制備與性質(zhì)評價(jià)

薄膜水化法制備包載多西他賽的普通膠束(以DSPE-mPEG2000為脂材，藥物和脂材質(zhì)量比為1∶30，簡稱DM)和含TPGS1000的膠束(以DSPE-mPEG2000和TPGS1000為脂材，脂材質(zhì)量比為1∶1，藥物和脂材質(zhì)量比為1∶30，簡稱TDM)[7]。

采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定膠束包封率、載藥量；采用激光散射納米粒度儀測定膠束的粒徑和zeta電位。HPLC條件：色譜柱為Diamonsil C18 (250 mm×46 mm, 5 μm)；洗脫條件為等濃度洗脫；流動相為乙腈∶水=57∶43，總流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測條件為紫外檢測器230 nm波長。包封率和載藥量計(jì)算公式如下：

包封率=過濾膜膠束稀釋樣品中DTX濃度/未過濾膜膠束稀釋樣品中DTX濃度×100%

載藥量=膠束中DTX量/(膠束中DTX量+脂材加入量)×100%

采用透射電鏡對聚合物膠束結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。將制備的載藥膠束稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，滴于銅網(wǎng)上，干燥后以1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))醋酸雙氧鈾負(fù)染，透射電子顯微鏡觀察。

1.3 4T1/Luc 細(xì)胞的體外生物發(fā)光活性鑒定

將4T1/Luc細(xì)胞進(jìn)行倍比稀釋于96孔板中，細(xì)胞數(shù)目依次為100 000、50 000、25 000、12 500個(gè)，每孔加入100 μL的細(xì)胞液，每個(gè)細(xì)胞濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基作為對照。測定前10～15 min，每孔加入200 μL熒光素酶底物D-Luciferin(150 mg/L)，將測量板置于活體生物發(fā)光成像儀中，檢測各孔細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。

1.4 轉(zhuǎn)移模型的建立

4T1/Luc細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長周期后，胰酶消化收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，得到1×107個(gè)/mL的細(xì)胞混懸液，取0.1 mL通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)[7,11]。

1.5 預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移效果評價(jià)

將通過尾靜脈接種了4T1/Luc細(xì)胞的小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組6只，接種當(dāng)天記為第0天。另外以未接種腫瘤細(xì)胞的小鼠作為對照(Control組)。實(shí)驗(yàn)組小鼠于第1、4、7天分別尾靜脈注射0.2 mL的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(Model組)、泰索帝(Taxotere?)、DM、TDM，DTX給藥劑量為10 mg/kg。第9天時(shí)，記錄體質(zhì)量后處死動物，剝離肺組織，肺部稱質(zhì)量后置于12孔板中且用熒光素酶底物D-Luciferin溶液(300 mg/L)浸泡，隨即將測量板置于活體生物發(fā)光成像儀中進(jìn)行生物發(fā)光成像。成像結(jié)束，PBS清洗后將肺組織浸泡在Bouin’s溶液中，24 h后拍照成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 聚合物膠束性質(zhì)評價(jià)

制備的兩種聚合物膠束(DM和TDM)溶液無色、澄清透明。如圖1和表1所示，兩種聚合物膠束呈現(xiàn)球狀，粒徑約20 nm，帶弱負(fù)電荷，包封率大于85%，載藥量約3%。與DM相比，TDM具有更小的粒徑、更高的包封率和載藥量。

圖1 包載多西他賽的聚合物膠束形態(tài)表征

表1 包載多西他賽的聚合物膠束性質(zhì)評價(jià)

**P<0.01vsDM group.DM:docetaxel-loaded micelles with DSPE-mPEG2000as lipid materials;TDM:docetaxel-loaded micelles with both DSPE-mPEG2000and TPGS1000as lipid materials.

2.2 4T1/Luc 細(xì)胞的體外生物發(fā)光活性鑒定

不同濃度的4T1/Luc細(xì)胞體外生物發(fā)光成像如圖2所示。結(jié)果顯示，對照組無明顯生物發(fā)光，說明該實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)基等對生物發(fā)光性質(zhì)的測定沒有干擾。4T1/Luc細(xì)胞體外生物發(fā)光性質(zhì)良好，且在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)生物發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成正比。

圖2 不同濃度的4T1/Luc細(xì)胞體外生物發(fā)光檢測

2.3 預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移效果評價(jià)

臟器系數(shù)可評價(jià)動物臟器病變的性質(zhì)和程度。不同制劑給藥組小鼠肺臟器系數(shù)如圖3所示，未注射腫瘤細(xì)胞的正常小鼠肺臟器系數(shù)為0.78%±0.05%，該值與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致。與正常小鼠相比，接種腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺臟器系數(shù)顯著增加，為1.72%±0.42%。Taxotere?、DM、TDM治療后可降低模型小鼠肺臟器系數(shù)，分別為1.54%±0.26%、1.17%±0.16%和0.94%±0.10%。

圖3 不同制劑給藥組小鼠肺臟器系數(shù)

將離體的小鼠肺浸泡在熒光素酶底物D-Luciferin溶液中，立即進(jìn)行離體組織的生物發(fā)光成像并對生物發(fā)光進(jìn)行半定量分析，結(jié)果如圖4A、B所示。正常組小鼠肺組織幾乎無自發(fā)生物發(fā)光，注射腫瘤細(xì)胞的模型組小鼠肺部生物發(fā)光最強(qiáng)，說明該組肺部腫瘤細(xì)胞最多，各制劑治療后肺部生物發(fā)光有不同程度下降，說明各制劑對小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移有抑制作用。TDM組抑制小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移作用最強(qiáng)。

各組小鼠肺組織經(jīng)Bouin’s溶液固定后照片如圖4C所示。對照組小鼠肺組織表面光滑，無腫瘤結(jié)節(jié)；注射腫瘤細(xì)胞的模型組小鼠肺組織表面結(jié)節(jié)密集；各制劑治療組小鼠肺組織表面結(jié)節(jié)數(shù)量減少，其中，TDM組肺組織表面相對光滑，腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)最少，呈現(xiàn)與對照組最為接近的表面形態(tài)，說明TDM組抑制小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移作用最強(qiáng)。

圖4 不同制劑給藥組小鼠肺轉(zhuǎn)移情況

3 討論

本研究制備的兩種聚合物膠束(以DSPE-mPEG2000為脂材的載多西他賽聚合物膠束DM，以DSPE-mPEG2000和TPGS1000質(zhì)量比為1∶1的載多西他賽聚合物膠束TDM)粒徑約為20 nm，含TPGS1000的TDM有更小的粒徑，可能與TPGS1000的親水鏈為PEG1000有關(guān)。該粒徑范圍的聚合物膠束在體循環(huán)中可逃避單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和腎小球?yàn)V過作用的清除[13-14]，也可避免發(fā)生加速血液消除現(xiàn)象[15-16]，因此可更長時(shí)間、更多數(shù)量地存在于血液循環(huán)。腫瘤部位血管呈現(xiàn)高滲透性，該粒徑的膠束可通過EPR效應(yīng)被動靶向至腫瘤部位[17]，為進(jìn)一步穿透并蓄積到腫瘤內(nèi)部提供先決條件。兩種聚合物膠束呈現(xiàn)弱負(fù)電性，可避免與血漿蛋白結(jié)合，進(jìn)而避免被巨噬細(xì)胞吞噬。同時(shí)，帶負(fù)電性的膠束也可跨越表面負(fù)電性的血管與細(xì)胞的排斥，順利進(jìn)入細(xì)胞[18]。膠束包封率和載藥量可滿足體內(nèi)給藥需求。與DM相比，TDM包封率和載藥量均有提升，是由于TPGS1000的疏水端為體積較大、表面積較大的維生素E琥珀酸酯，使得TPGS1000與疏水性藥物的相互作用更強(qiáng)，因而當(dāng)以TPGS1000作為部分脂材構(gòu)建膠束時(shí)，可增加包封率[19]。

臟器系數(shù)可評價(jià)動物臟器病變的性質(zhì)和程度。正常狀態(tài)的動物臟器系數(shù)差別不大。臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。本研究中正常小鼠肺臟器系數(shù)為0.78%±0.05%，肺轉(zhuǎn)移模型小鼠臟器系數(shù)顯著增加，說明肺部病變程度高。各制劑治療組可降低模型小鼠肺臟器系數(shù)，其中TDM組最小且與正常小鼠組最為接近，說明TDM組小鼠肺組織病變程度最低，從一定程度上反映了TDM組有更好地抑制小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移作用。

生物發(fā)光是基于熒光素酶能催化底物化學(xué)發(fā)光的原理，將體外能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株植入動物體內(nèi)，與后期注射入體內(nèi)的底物發(fā)生反應(yīng)，利用光學(xué)系統(tǒng)檢測光強(qiáng)度，間接反映出細(xì)胞數(shù)量的變化或細(xì)胞的定位。這項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如腫瘤或疾病動物模型的建立、病毒學(xué)研究、siRNA 研究、干細(xì)胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究等。螢火蟲熒光素酶/D-Luciferin是一對常用的熒光素酶/底物，發(fā)光原理為：在ATP、O2存在時(shí)，螢火蟲熒光素酶催化D-Luciferin氧化脫羧自發(fā)發(fā)光，該體系不需要激發(fā)光，具有較高靈敏性且生物發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量成正比[20-21]。本研究中不同濃度的4T1/Luc細(xì)胞體外生物發(fā)光性質(zhì)良好，且發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成正比，為后續(xù)研究各制劑對小鼠肺組織轉(zhuǎn)移抑制作用提供了方法基礎(chǔ)。離體的肺組織體外生物發(fā)光強(qiáng)度可間接反映肺部腫瘤數(shù)量。各制劑治療后可降低模型小鼠肺組織生物發(fā)光強(qiáng)度，其中，TDM組生物發(fā)光強(qiáng)度最低。

肺部轉(zhuǎn)移的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目也可作為抑制肺轉(zhuǎn)移效果的評價(jià)指標(biāo)[22]。Bouin’s固定液可用于維持細(xì)胞和組織的原有形態(tài)，經(jīng)Bouin’s固定液固定的肺組織更易觀察表面腫瘤結(jié)節(jié)[23]。模型組小鼠肺部表面結(jié)節(jié)數(shù)量最多，說明小鼠肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建成功。各制劑治療后可降低模型小鼠肺部結(jié)節(jié)數(shù)量，使肺組織表面更加光滑，其中TDM組肺部腫瘤結(jié)節(jié)最少。

綜上，肺部臟器系數(shù)、生物發(fā)光成像、生物發(fā)光半定量和表面腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目均呈現(xiàn)較為一致的結(jié)果，即TDM組有最強(qiáng)的抑制小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移作用?？赡苁荄TX與TPGS1000共同發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)果。