白細(xì)胞介素-21與復(fù)發(fā)性鼻息肉組織中IgE的相關(guān)性分析

杜 崑 鄭 銘 王向東 張 羅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730)

在西方國家，85%的鼻息肉患者表現(xiàn)為以2型免疫為主的嗜酸性炎性反應(yīng)并伴有組織內(nèi)總IgE的升高[1]，高IgE表達(dá)的強(qiáng)2型免疫反應(yīng)也與疾病術(shù)后的復(fù)發(fā)密切相關(guān)[2]。目前針對(duì)IgE的單克隆抗體被證實(shí)可有效治療鼻息肉[3]，這表明息肉組織內(nèi)增多的IgE可能參與了鼻息肉的致病過程。亞洲人鼻息肉的免疫特點(diǎn)與西方國家存在顯著差異[4]，近年來2型免疫反應(yīng)在中國患者的鼻息肉局部呈逐年增加的趨勢[5]。

從外周血循環(huán)遷移到息肉組織內(nèi)的初始B細(xì)胞，在抗原刺激下，經(jīng)Tfh細(xì)胞輔助增生形成生發(fā)中心，進(jìn)而發(fā)育為成熟的IgE型漿細(xì)胞并參與免疫過程。在生發(fā)中心反應(yīng)中，源于Tfh細(xì)胞的CD40分子配體(CD40 ligand, CD40L)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-21和IL-4參與到了T-B細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞并促進(jìn)IgE型B細(xì)胞分化成熟[6]。IgE在復(fù)發(fā)的慢性鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)患者中表達(dá)增高[2, 7]，但是作為在生發(fā)中心反應(yīng)中IgE合成的關(guān)鍵分子，CD40L和IL-21對(duì)鼻息肉復(fù)發(fā)的影響仍不清楚，它們對(duì)易復(fù)發(fā)和不易復(fù)發(fā)的鼻息肉患者的IgE產(chǎn)生是否發(fā)揮著不同的作用仍不清楚。

本研究旨在探討IL-4、CD40L和IL-21對(duì)疾病復(fù)發(fā)的影響,并進(jìn)一步分析CD40L和IL-21在術(shù)后3年時(shí)間內(nèi)的復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)性鼻息肉患者中對(duì) IgE產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步的臨床生物治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2011年1月至2012年12月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科并行鼻內(nèi)鏡下鼻竇開放和鼻息肉切除手術(shù)的CRSwNP患者73例和無鼻腔鼻竇疾病的健康受試者24例，CRSwNP患者中男性53例(72.6%)，女性20例(27.4%)，平均年齡為(45.03±13.53)歲；健康受試者中男性18例(75%)，女性6例(25%)，平均年齡為(40.83±13.20)歲。所有患者CRSwNP的診斷符合2012年EPOS指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡>16歲的雙側(cè)CRSwNP患者，且術(shù)前4周內(nèi)未使用鼻噴和口服糖皮質(zhì)激素治療和無急性上呼吸道感染者。排除標(biāo)準(zhǔn):年齡不滿16周歲，合并有免疫缺陷、囊性纖維化、真菌性鼻竇炎和單側(cè)鼻竇炎患者。根據(jù)隨訪時(shí)間內(nèi)疾病是否復(fù)發(fā)進(jìn)行分組(復(fù)發(fā)組33例，未復(fù)發(fā)組40例)。本研究方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(批號(hào)：TREC2011-21)，參與研究的受試患者均簽署知情同意書。

入組的CRSwNP患者術(shù)前記錄性別、年齡、哮喘病史和吸煙史等臨床資料。行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)記錄患者是否伴有變應(yīng)性因素，待測吸入過敏原包括：樹木組合(柳樹/楊樹/榆樹)、普通豚草、艾蒿、室內(nèi)塵螨組合(屋塵螨/粉塵螨)、屋塵、貓、狗、蟑螂和霉菌。采集外周血并記錄嗜酸性粒細(xì)胞百分比，術(shù)后給予規(guī)范藥物治療2～3個(gè)月，藥物治療方案包括規(guī)律使用鼻噴糖皮質(zhì)激素、黏液促排劑和0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液鼻沖洗。對(duì)所有患者門診隨訪3年以上，息肉復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：經(jīng)鼻內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)帶蒂息肉樣新生物形成，鼻塞、流涕、頭痛和嗅覺減退癥狀中伴有2項(xiàng)或2項(xiàng)以上，再次給予常規(guī)藥物治療3個(gè)月后癥狀無法改善者。

1.2 免疫學(xué)檢測

手術(shù)中獲取受試者的鼻息肉樣本后凍存于-80 ℃ 冰箱，待受試者完成隨訪后取出并制備組織勻漿，制備方法參照文獻(xiàn)[10]。即獲取冰凍組織100 mg，在含有少量液氮的培養(yǎng)皿中約切成2 mm×2 mm，之后將組織連同磁珠置入勻漿儀(德國B.Braun-Melsungen公司)高速勻漿處理15 min，加入含有1%蛋白酶抑制劑(美國Sigma Aldrich 公司)的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液并離心3 000 r/min,10 min，4 ℃，收集離心后上清液凍存于-80 ℃待檢測時(shí)取出。

通過Luminex檢測試劑盒(美國R&D Systems公司)，通過Bio-Plex 200(美國BioRad公司)檢測凍存的上清液中IL-4、IL-21和CD40L；使用ImmunoCAP(瑞典Phadia公司)檢測總IgE濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)的正態(tài)性分布，符合正態(tài)分布的定量資料使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)比組間差異和Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析變量之間的相關(guān)性；不符合正態(tài)分布的定量資料使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)比組間差異和Sperman相關(guān)性檢驗(yàn)分析變量之間的相關(guān)性。對(duì)于定性臨床資料采用χ2檢驗(yàn)對(duì)比組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征分析

73例CRSwNP患者和24例無鼻腔鼻竇疾病的健康受試者的人口學(xué)特征和臨床特征見表1。兩組患者年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，外周血Eos計(jì)數(shù)、吸煙者和哮喘者比例以及組織總IgE濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)CRSwNP患者的免疫學(xué)特征分析

73例患者均接受了功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療，手術(shù)方式包括篩竇/上頜竇開放術(shù)、額竇/篩竇/上頜竇開放術(shù)、蝶竇/篩竇/上頜竇開放術(shù)和全組鼻竇開放術(shù)，兩組患者接受的手術(shù)方式比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)發(fā)組患者的組織總IgE和患有哮喘病史患者的比例顯著高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；復(fù)發(fā)組患者外周血Eos百分比雖然明顯高于未復(fù)發(fā)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者間息肉組織內(nèi)的IL-21、CD40L和IL-4比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

2.3 CRSwNP復(fù)發(fā)相關(guān)的Logistic回歸分析

以術(shù)后門診隨訪3年后CRSwNP患者的復(fù)發(fā)與否為因變量，以鼻息肉組織勻漿中的總IgE、IL-21、IL-4和CD40L為自變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析。經(jīng)回歸分析后證實(shí)局部鼻息肉組織內(nèi)高表達(dá)的IgE是術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，而IL-4、CD40L和IL-21與疾病的復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)性(表3)。

表1 CRSwNP患者和健康受試者的臨床特征

CharacteristicsControl (n=24)CRSwNP (n=73)PGender (male/female)18/653/200.818Age/a40.83±13.2045.03±13.530.186Blood eosinophils/%1.60 (1.40-3.00)5.20 (2.95-8.40)<0.001Asthma0 (0)14 (19.18)0.018Smoker3 (12.5)32 (43.84)0.006Recurrence (recurrence/non-recurrence)-33/40-Tissue total IgE/(KU·L-1)1.04 (0-3.52)150.70 (67.76-407.28)<0.001

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

表2 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)CRSwNP患者的臨床特征與免疫學(xué)特征

CharacteristicsNon-recurrence (n=40)Recurrence (n=33)PGender (male/female)32/828/50.590Age/a44.53±14.9545.65±11.670.723Blood eosinophils/%4.40 (2.50-7.20)5.95 (3.7-9.45)0.070Asthma4 (10)10 (30.3)0.028Skin prick test positive13 (32.5)9 (27.3)0.628Smoker18 (45.0)14 (42.42)0.825Surgical proceduresBilateral patency of ethmoidal and maxillary sinus5 (12.5)1 (3.0)0.212Bilateral patency of frontal, ethmoidal and maxillary si-nus5 (12.5)4 (12.1)1.000Bilateral patency of sphenoid, ethmoidal and maxillary sinus4 (10.0)4 (12.1)1.000Bilateral patency of all four sinus26 (65.0)24 (72.7)0.479IL-4/(pg·mL-1)3.14 (3.14-74.14)3.14 (3.14-74.14)0.802IL-21/(ng·mL-1)1.72±0.741.82±1.210.694CD40L/(pg·mL-1)320.21 (167.09-552.31)304.09 (167.20-776.05)0.825Tissue total IgE/(KU·L-1)98.89 (43.56-255.20)257.40 (143.00-776.05)<0.001

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps；IL: interleukin;CD40L: CD40 ligand.

表3 CRSwNP術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的二元Logistic回歸分析結(jié)果

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps;IL: interleukin;CD40L: CD40 ligand.

2.4 IL-21與易復(fù)發(fā)的CRSwNP組織中IgE的相關(guān)性

由于組織總IgE在復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Logistic回歸分析表明鼻息肉局部增多的IgE是復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，故而進(jìn)一步分析與IgE差異表達(dá)相關(guān)的免疫分子。在73例患者中，組織總IgE與IL-21水平呈正相關(guān)(r=0.290，P=0.01)(圖1A)，與CD40L、IL-4無相關(guān)性；CD40L與IL-21呈正相關(guān)(r=0.440，P<0.001)(圖1B)。根據(jù)疾病的復(fù)發(fā)與否對(duì)患者進(jìn)行分組發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)組中，IgE與IL-4和CD40L無明顯相關(guān)，與IL-21呈顯著相關(guān)(r=0.374，P=0.029)(圖1C, D)；未復(fù)發(fā)組中IgE與IL-4、CD40L和IL-21均無相關(guān)性。

圖1 免疫學(xué)分子相關(guān)性分析

3 討論

CRSwNP是一種高度異質(zhì)性疾病，根據(jù)其局部組織的病理和免疫學(xué)特征不同又可分為不同的內(nèi)在型，不同內(nèi)型疾病對(duì)藥物的敏感性和手術(shù)治療的效果也不同[11]。對(duì)于嚴(yán)重的2型免疫反應(yīng)介導(dǎo)的CRSwNP術(shù)后復(fù)發(fā)概率更大，為患者的生活質(zhì)量帶來了極大的困擾，也極大地增加了社會(huì)和個(gè)人的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。IgE是2型免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵分子，與哮喘的合并發(fā)生和術(shù)后疾病的復(fù)發(fā)有著密切關(guān)系[12]。雖然目前使用IgE單克隆抗體對(duì)其進(jìn)行靶向治療可以有效改善疾病嚴(yán)重程度，但是其臨床應(yīng)用也存在一定限制，如臨床不良反應(yīng)和昂貴的價(jià)格等，故而深入研究參與疾病復(fù)發(fā)的IgE相關(guān)的免疫分子可以為后續(xù)的生物治療提供可靠的理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)的CRSwNP其局部組織內(nèi)有著更高濃度的IgE，并且合并有哮喘病史的比例更高，這與既往研究[13]的相關(guān)結(jié)果是一致的。另外本研究中外周血中Eos在復(fù)發(fā)組中的含量明顯高于未復(fù)發(fā)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能是與數(shù)據(jù)的離散分布和樣本量較小有關(guān)。經(jīng)過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)組織局部增多的IgE是CRSwNP復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，而IL-4、CD40L和IL-21與疾病的復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)。同樣，雖然復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組IL-4、CD40L和IL-21組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是在復(fù)發(fā)組中，組織內(nèi)IgE的含量與IL-21是呈正相關(guān)。這表明CD40L、IL-4和IL-21并沒有直接參與疾病的復(fù)發(fā)，但是IgE作為2型免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子與疾病的復(fù)發(fā)相關(guān)，而IL-21可能協(xié)助參與了復(fù)發(fā)組鼻息肉組織中IgE的合成。

IgE在息肉組織中的合成有賴于IgE分泌型的漿細(xì)胞的存在。在骨髓中發(fā)育成熟的初始B細(xì)胞經(jīng)外周血到達(dá)二級(jí)淋巴器官(如脾臟和淋巴結(jié))和黏膜淋巴組織中。近年來有研究[14-15]證實(shí)，鼻息肉組織內(nèi)淋巴細(xì)胞豐富，可能成為一種異位淋巴組織,并且最近有多項(xiàng)研究在息肉組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了生發(fā)中心樣結(jié)構(gòu)，這表明息肉組織內(nèi)存在B細(xì)胞的發(fā)育成熟和漿細(xì)胞的分化形成。在經(jīng)典的生發(fā)中心反應(yīng)過程中，濾泡輔助T細(xì)胞(follicular helper T)通過其胞膜表面的CD40L和T細(xì)胞抗原識(shí)別受體(T-cell antigen receptor,TCR)與分別B細(xì)胞膜上的CD40分子和MHC II類分子結(jié)合完成細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)B細(xì)胞的發(fā)育成熟[16]。IgM型初始B細(xì)胞在這個(gè)反應(yīng)過程中根據(jù)Tfh細(xì)胞所釋放的信號(hào)不同而分化發(fā)育為不同類型的漿細(xì)胞(如IgG型、IgA型和IgE型)，在IL-21和IL-4的作用下可以誘導(dǎo)初始B細(xì)胞發(fā)生類別轉(zhuǎn)化進(jìn)而分化發(fā)育為IgE型漿細(xì)胞[17]。故而，CD40L、IL-4和IL-21都是參與最終IgE產(chǎn)生的關(guān)鍵分子。在本研究中CD40L與IL-21有顯著相關(guān)性，這與IL-21和CD40L在生發(fā)中心反應(yīng)中的協(xié)同作用是一致的。在未復(fù)發(fā)的CRSwNP患者中，IgE與CD40L、IL-21和IL-4均無相關(guān)性，然而在復(fù)發(fā)的CRSwNP患者中IgE與IL-21呈顯著正相關(guān)。這表明在術(shù)后3年里易復(fù)發(fā)和不易復(fù)發(fā)的CRSwNP其IgE的產(chǎn)生機(jī)制可能是不同的。基于IgE產(chǎn)生的免疫學(xué)分子機(jī)制和本研究的結(jié)果，筆者推測在未復(fù)發(fā)的患者中，其IgE的產(chǎn)生可能更多是來源于外周血遷移而來的漿細(xì)胞而非在局部接受抗原提呈后直接發(fā)生了分化成熟；在復(fù)發(fā)的患者中，其IgE的產(chǎn)生與源于局部的分化發(fā)育成熟有關(guān)，這需要在未來的研究中進(jìn)一步從分子和細(xì)胞層面去證實(shí)。

CRSwNP的本質(zhì)是一種鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎性增生性疾病，雖然目前對(duì)于經(jīng)過藥物治療3個(gè)月以上無效的患者需要采用鼻內(nèi)鏡手術(shù)干預(yù)來緩解鼻腔癥狀，這并不能從發(fā)病原因上遏制其發(fā)病，故而隨著隨訪時(shí)間的延長，越來越多的患者出現(xiàn)了疾病的復(fù)發(fā)。在Calus等[18]的一項(xiàng)長達(dá)12年的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，80%的CRSwNP患者出現(xiàn)了疾病的復(fù)發(fā)現(xiàn)象，其中有37%的患者需要再次接受手術(shù)治療以達(dá)到緩解癥狀的目的。故而深入的研究其發(fā)病和復(fù)發(fā)的分子機(jī)制，找到更多可靠的靶向治療分子，提高生物治療的臨床選擇和應(yīng)用范圍，以逐步實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病治愈的臨床目的。本研究證實(shí)了在中國人群中，CRSwNP患者相比健康人群而言，其鼻腔組織內(nèi)的IgE含量是增多的，并且增多的IgE與疾病的復(fù)發(fā)是相關(guān)的。之后，從與IgE合成相關(guān)的免疫分子中篩選到CD40L、IL-4和IL-21，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IL-21可能參與到了復(fù)發(fā)病例中IgE的合成。本研究的不足之處在于未能從細(xì)胞層面對(duì)其進(jìn)一步佐證，這需要在接下來的研究中不斷完善。盡管如此，本研究證實(shí)了IL-21而不是CD40L與復(fù)發(fā)的CRSwNP中IgE的合成的關(guān)系，為將來的生物靶向治療提供理論參考依據(jù)。