呂 穎
(北京市北運(yùn)河管理處,北京 101101)
水環(huán)境有機(jī)污染物主要來(lái)源于人類活動(dòng),具體包括生活污水、畜禽養(yǎng)殖廢水及各類工業(yè)廢水[1]。污染水環(huán)境的主要物質(zhì)有石油類、農(nóng)藥、表面活性劑以及酚類等化學(xué)物質(zhì),還有一些腐殖質(zhì)、多糖類等非揮發(fā)性的有機(jī)物質(zhì),這些污染物在轉(zhuǎn)化降解時(shí)會(huì)消耗水中的溶解氧,惡化水質(zhì),破壞生態(tài)平衡[2]。微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程是通過(guò)微生物細(xì)胞修復(fù)復(fù)雜的底物結(jié)構(gòu),即使用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶,催化底物反應(yīng)[3]。代謝調(diào)控可以打破微生物細(xì)胞內(nèi)的自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制,使其朝著人們所期望的方向發(fā)展。研究水環(huán)境有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化的代謝調(diào)控,可以更好地監(jiān)測(cè)水環(huán)境中的污染物的變化,改善水質(zhì)[4]。
實(shí)驗(yàn)采用居民居住區(qū)周圍的河流水源,在水源周圍設(shè)立3個(gè)不同的水樣采集點(diǎn)(A、B、C點(diǎn)),采集點(diǎn)A、B、C具體位置見(jiàn)圖1。
圖1 水樣采集點(diǎn)位置
有關(guān)研究表明:真菌分裂、生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)都與碳濃度大小有關(guān),在真菌中起著調(diào)節(jié)傳輸物質(zhì)的作用,還會(huì)調(diào)節(jié)氨基酸的傳輸,不同的微生物體內(nèi)都有特異代謝方式[5]。實(shí)驗(yàn)使用長(zhǎng)孢葡萄穗酶,將菌株接種于種子培養(yǎng)液中,培養(yǎng)3天后獲得微生物子液,再將甘油與生理鹽水調(diào)和為4∶6的比例混合均勻,將此時(shí)的混合液與微生物子液按照1∶1的比例混合于凍藏管,放在-80℃冷凍室中保存。新鮮的微生物子液放置在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天,獲得孢子,然后將獲得的孢子置于冷凍真空干燥的環(huán)境中保存[6]。
使用直徑90mm、高15mm、容量13mL×3格的一次性微生物培養(yǎng)皿,為方便對(duì)比,培養(yǎng)基配置3種培養(yǎng)基溶液:斜面培養(yǎng)基(PSA培養(yǎng)基)、種子培養(yǎng)基(GSB培養(yǎng)基)以及原始發(fā)酵培養(yǎng)基(改良查氏培養(yǎng)基)。
斜面培養(yǎng)基:將土豆去皮,切成薄片取30g,加入70g蒸餾水,煮至土豆松軟,使用四層紗布將土豆變?yōu)槟酄?,制成濃度?5g/L的土豆溶液。加入蔗糖15g/L,瓊脂20g/L,然后將整個(gè)培養(yǎng)基的水分補(bǔ)水至100mL,然后放入微波爐中加熱直至瓊脂全部溶解的狀態(tài),斜面培養(yǎng)基中的溶液制作完畢,將溶液分裝到試管中[7]。
種子培養(yǎng)基的具體配置成分見(jiàn)表1?;旌媳?中的各成分,使用6號(hào)成分的鹽酸將培養(yǎng)基溶液的pH值調(diào)節(jié)至6。
表1 種子培養(yǎng)基配置成分濃度
原始發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配置見(jiàn)表2?;旌媳?中的各成分,使用11號(hào)濃度的鹽酸將培養(yǎng)皿溶液的pH值調(diào)節(jié)至6。
制備好以上3種培養(yǎng)基,全部置于121℃條件下滅菌15min。
表2 原始發(fā)酵培養(yǎng)基配置各成分濃度
續(xù)表
斜面培養(yǎng)條件:將凍庫(kù)管中的菌液均勻涂布于斜面培養(yǎng)基中,放置霉菌培養(yǎng)箱中,保持培養(yǎng)箱的溫度為25℃,培養(yǎng)6天。
種子培養(yǎng)條件:使用接種環(huán)在菌種斜面上刮取拇指大小的菌體,接種到種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中,將錐形瓶放置在25℃、180r/min搖床中培養(yǎng)6天。
發(fā)酵培養(yǎng)條件:取2mL種子培養(yǎng)基中的液體,接種到200mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,將其置于25℃、180r/min搖床中培養(yǎng)6天[8]。
實(shí)驗(yàn)試劑包括瓊脂、蔗糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、無(wú)水硫化鈣、氯化鈣、氯化鈉、氯化鈷、鹽酸、葡萄糖、氯化鉀、硫酸亞鐵、可溶性淀粉、脫脂大豆粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母提取物;實(shí)際代謝調(diào)控時(shí)的儀器使用霉菌培養(yǎng)箱[9]。
調(diào)控前先將接種方式更改為直接接種孢子的方式,依據(jù)轉(zhuǎn)化時(shí)間,更換培養(yǎng)條件:將300萬(wàn)個(gè)孢子接種于100mL種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中,接種量為5%,培養(yǎng)26~28h。培養(yǎng)溫度均為25℃,轉(zhuǎn)速為180r/min。菌體在培養(yǎng)基內(nèi)要維持生長(zhǎng)需要的足夠的碳,搖動(dòng)發(fā)酵液后,此時(shí)微生物代謝會(huì)進(jìn)入TCA循環(huán),產(chǎn)生大量的能量供給微生物的生命活動(dòng)[10]。改變常見(jiàn)碳源的濃度梯度,或改變常見(jiàn)碳源的成分,將碳濃度設(shè)定為表3中數(shù)值。
使用表3中調(diào)控的碳源濃度,設(shè)定3種不同梯度碳源濃度,發(fā)酵期為6天,使用150mL的錐形瓶,裝取75mL混有3種不同濃度的碳源的培養(yǎng)液[11]。計(jì)算菌體濕重公式為
(1)
式中:W為菌體濕重;CS為培養(yǎng)基面積;FS為視野面積;Fn為每片計(jì)數(shù)過(guò)的視野數(shù);V為1L水經(jīng)沉淀濃縮后的體積;v為計(jì)數(shù)框體積;Pn為每片通過(guò)計(jì)算實(shí)際數(shù)出的菌類個(gè)數(shù)[12]。
菌體干重的計(jì)算公式為
(2)
式中:M為菌體干重;x,y為培養(yǎng)基觀測(cè)位置;t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間;C為(x,y)處t時(shí)刻碳濃度;n為pH值大??;Dx為橫向彌散系數(shù);Dy為縱向彌散系數(shù)[13]。
1.5.1 低碳源
將發(fā)酵液搖晃均勻后,取10mL置于布氏漏斗中,同時(shí)加入100mL去離子水沖洗,真空抽濾,水分抽濾干后將濾紙置于65℃烘箱中11h,烘干,然后置于干燥器中恒重24h,稱重,計(jì)算菌體干重。
1.5.2 中碳源
取發(fā)酵液750μL于2mL的離心管中,加入750μL發(fā)酵液與甲醛1∶1萃取后的溶液,混合均勻后,使用超聲波超聲提取5min,使用1mL注射器吸取溶液上部分清液,然后使用尺寸為0.45μm的濾頭過(guò)濾,用高效液相色譜測(cè)定菌體的干濕重。
1.5.3 高碳源
高碳源調(diào)控方法使用HPLC檢測(cè),設(shè)定檢測(cè)條件為Kromasil-C18液相色譜柱,柱溫40℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為260mm,流速為1mL/min,進(jìn)樣量為20μL,流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸和乙腈線性梯度洗脫。設(shè)置洗脫梯度為:0.01~30.00min,45%B相;30.00~35.00min,85%B相[14]。配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mg/L、25mg/L、55mg/L、95mg/L、125mg/L、225mg/L、325mg/L、425mg/L、525mg/L),計(jì)算得到相峰積分,然后計(jì)算各個(gè)相峰面積,得到菌體干濕重大小。使用峰面積對(duì)碳濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(回歸系數(shù)R2=0.99),標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式為
y=16.591x+8.9933
(3)
式中:其中回歸系數(shù)為R2=0.9998;x為時(shí)間,min[15]。
不同菌種類型會(huì)產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物,而同一種菌種在產(chǎn)生代謝產(chǎn)物時(shí),對(duì)應(yīng)最佳菌體的重量也不同,調(diào)控微生物轉(zhuǎn)化時(shí),控制3種不同濃度的碳源,統(tǒng)計(jì)調(diào)控6天培養(yǎng)基,得到的低碳濃度的菌體干濕重變化見(jiàn)圖2。
圖2 低濃度碳源菌體干濕重變化
由圖2可知:控制低碳源濃度為0~35000mg/L時(shí),隨著時(shí)間的增長(zhǎng),菌體濕重穩(wěn)步增長(zhǎng),在約126h時(shí),濕重開始減小,最終維持在38~40g之間。菌體在78h時(shí),干重開始下降,但在90h時(shí),又恢復(fù)穩(wěn)固上升的趨勢(shì)。
維持中濃度碳源在7000~42000mg/L,隨著水分的蒸發(fā),前幾個(gè)小時(shí)菌體生長(zhǎng)旺盛,菌液黏稠。將通氣調(diào)至最高,補(bǔ)加水增強(qiáng)控制菌的攝氧率,增強(qiáng)有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化代謝過(guò)程。中濃度碳源菌體干濕重變化見(jiàn)圖3。
圖3 中濃度碳源菌體干濕重變化
由圖3可知:維持中濃度碳源,在96h時(shí),菌體濕重大小發(fā)生小轉(zhuǎn)折,但依舊保持上升趨勢(shì);而此時(shí)的菌體干重并沒(méi)有發(fā)生明顯變化,最終維持在10g左右。
增加碳源種類,將碳源濃度保持在21000~56000mg/L的高濃度區(qū)間內(nèi),菌體在此濃度下,自體產(chǎn)生自行代謝,并產(chǎn)生大量的前體,此時(shí)的菌體干濕重量變化見(jiàn)圖4。
圖4 高濃度碳源菌體干濕重變化
由圖4可知:維持高濃度碳源,菌體在20h時(shí),濕重逐漸增加,大小增長(zhǎng)到40g。而干重保持增長(zhǎng),到120h時(shí),干重大小變?yōu)?0g,之后干重減小,實(shí)驗(yàn)完畢后,菌體干重維持在10g左右。
在培養(yǎng)基發(fā)酵后期,菌體生長(zhǎng)緩慢,殘?zhí)橇枯^低。維持正常代謝過(guò)程時(shí)需要足夠的碳骨架,碳骨架會(huì)產(chǎn)生代謝過(guò)程的關(guān)鍵中間體FGFC3,但在低碳濃度環(huán)境下的合成能力較低,所以代謝過(guò)程在72h時(shí),F(xiàn)GFC3開始積累,才可以維持正常的代謝過(guò)程,調(diào)控方式基本奏效。在124h之后,由于殘?zhí)橇窟^(guò)低,培養(yǎng)基發(fā)酵液環(huán)境內(nèi)的pH值迅速升高,導(dǎo)致代謝所需的FGFC3無(wú)法正常產(chǎn)生,破壞了發(fā)酵體系。此時(shí)的菌體濕重、干重波動(dòng)較大,調(diào)控效果最明顯。
在20h時(shí),逐漸產(chǎn)生FGFC3,沒(méi)有出現(xiàn)二次積累,并隨著時(shí)間的持續(xù)積累呈現(xiàn)出一種小幅度的波動(dòng)變化。中碳濃度的調(diào)控環(huán)境,可以提供足夠的碳骨架,幫助產(chǎn)生更多的FGFC3。但剩下的中濃度碳源會(huì)在一段時(shí)間內(nèi),打破代謝平衡。隨著時(shí)間的增加,代謝會(huì)產(chǎn)生一種由正常代謝到打破正常代謝,最終又恢復(fù)正常代謝的循環(huán)過(guò)程,導(dǎo)致圖2中濕重不斷增加、干重基本保持不變的情況。調(diào)控效果不明顯,基本不影響水環(huán)境有機(jī)污染物微生物的轉(zhuǎn)化。
代謝過(guò)程中的酶會(huì)將鳥氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸,瓜氨酸參與到代謝過(guò)程中反應(yīng),轉(zhuǎn)換形成精氨琥珀酸,然后在酶的催化下,裂解水解后形成尿素,加快了代謝過(guò)程。所以在72h之后,殘?zhí)橇康?,高濃度的碳源?huì)合成更多的FGFC3,剩余的碳源會(huì)因?yàn)闈舛冗^(guò)高,經(jīng)干燥后增加了菌體的干重。在120h時(shí),經(jīng)過(guò)干燥后的碳會(huì)變成區(qū)別于菌體的黑色固體,去除殘余的黑色碳,得到菌體干重大小變化。因此,高濃度調(diào)控環(huán)境,代謝調(diào)控效果一般。
在當(dāng)今蓬勃發(fā)展的社會(huì),疏忽對(duì)環(huán)境的保護(hù),會(huì)造成環(huán)境的污染。研究水環(huán)境有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化的代謝調(diào)控,可以更科學(xué)地治理被有機(jī)污染物污染的水環(huán)境,更加全面地研究水環(huán)境內(nèi)存在的有機(jī)污染物,有助于水環(huán)境的治理,使經(jīng)濟(jì)發(fā)展與環(huán)境發(fā)展相協(xié)調(diào),實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。