水環(huán)境有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化的代謝調(diào)控研究

呂 穎

(北京市北運(yùn)河管理處，北京 101101)

水環(huán)境有機(jī)污染物主要來(lái)源于人類活動(dòng)，具體包括生活污水、畜禽養(yǎng)殖廢水及各類工業(yè)廢水[1]。污染水環(huán)境的主要物質(zhì)有石油類、農(nóng)藥、表面活性劑以及酚類等化學(xué)物質(zhì)，還有一些腐殖質(zhì)、多糖類等非揮發(fā)性的有機(jī)物質(zhì)，這些污染物在轉(zhuǎn)化降解時(shí)會(huì)消耗水中的溶解氧，惡化水質(zhì)，破壞生態(tài)平衡[2]。微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程是通過(guò)微生物細(xì)胞修復(fù)復(fù)雜的底物結(jié)構(gòu)，即使用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶，催化底物反應(yīng)[3]。代謝調(diào)控可以打破微生物細(xì)胞內(nèi)的自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制，使其朝著人們所期望的方向發(fā)展。研究水環(huán)境有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化的代謝調(diào)控，可以更好地監(jiān)測(cè)水環(huán)境中的污染物的變化，改善水質(zhì)[4]。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)有機(jī)物及微生物

實(shí)驗(yàn)采用居民居住區(qū)周圍的河流水源，在水源周圍設(shè)立3個(gè)不同的水樣采集點(diǎn)(A、B、C點(diǎn))，采集點(diǎn)A、B、C具體位置見(jiàn)圖1。

圖1 水樣采集點(diǎn)位置

有關(guān)研究表明:真菌分裂、生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)都與碳濃度大小有關(guān)，在真菌中起著調(diào)節(jié)傳輸物質(zhì)的作用，還會(huì)調(diào)節(jié)氨基酸的傳輸，不同的微生物體內(nèi)都有特異代謝方式[5]。實(shí)驗(yàn)使用長(zhǎng)孢葡萄穗酶，將菌株接種于種子培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3天后獲得微生物子液，再將甘油與生理鹽水調(diào)和為4∶6的比例混合均勻，將此時(shí)的混合液與微生物子液按照1∶1的比例混合于凍藏管，放在-80℃冷凍室中保存。新鮮的微生物子液放置在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，獲得孢子，然后將獲得的孢子置于冷凍真空干燥的環(huán)境中保存[6]。

1.2 培養(yǎng)基

使用直徑90mm、高15mm、容量13mL×3格的一次性微生物培養(yǎng)皿，為方便對(duì)比，培養(yǎng)基配置3種培養(yǎng)基溶液：斜面培養(yǎng)基(PSA培養(yǎng)基)、種子培養(yǎng)基(GSB培養(yǎng)基)以及原始發(fā)酵培養(yǎng)基(改良查氏培養(yǎng)基)。

斜面培養(yǎng)基：將土豆去皮，切成薄片取30g，加入70g蒸餾水，煮至土豆松軟，使用四層紗布將土豆變?yōu)槟酄?，制成濃度?5g/L的土豆溶液。加入蔗糖15g/L，瓊脂20g/L，然后將整個(gè)培養(yǎng)基的水分補(bǔ)水至100mL，然后放入微波爐中加熱直至瓊脂全部溶解的狀態(tài)，斜面培養(yǎng)基中的溶液制作完畢，將溶液分裝到試管中[7]。

種子培養(yǎng)基的具體配置成分見(jiàn)表1?；旌媳?中的各成分，使用6號(hào)成分的鹽酸將培養(yǎng)基溶液的pH值調(diào)節(jié)至6。

表1 種子培養(yǎng)基配置成分濃度

原始發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配置見(jiàn)表2?；旌媳?中的各成分，使用11號(hào)濃度的鹽酸將培養(yǎng)皿溶液的pH值調(diào)節(jié)至6。

制備好以上3種培養(yǎng)基，全部置于121℃條件下滅菌15min。

表2 原始發(fā)酵培養(yǎng)基配置各成分濃度

續(xù)表

1.3 原始培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)條件：將凍庫(kù)管中的菌液均勻涂布于斜面培養(yǎng)基中，放置霉菌培養(yǎng)箱中，保持培養(yǎng)箱的溫度為25℃，培養(yǎng)6天。

種子培養(yǎng)條件：使用接種環(huán)在菌種斜面上刮取拇指大小的菌體，接種到種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，將錐形瓶放置在25℃、180r/min搖床中培養(yǎng)6天。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：取2mL種子培養(yǎng)基中的液體，接種到200mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，將其置于25℃、180r/min搖床中培養(yǎng)6天[8]。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)試劑包括瓊脂、蔗糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、無(wú)水硫化鈣、氯化鈣、氯化鈉、氯化鈷、鹽酸、葡萄糖、氯化鉀、硫酸亞鐵、可溶性淀粉、脫脂大豆粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母提取物；實(shí)際代謝調(diào)控時(shí)的儀器使用霉菌培養(yǎng)箱[9]。

1.5 調(diào)控方法

調(diào)控前先將接種方式更改為直接接種孢子的方式，依據(jù)轉(zhuǎn)化時(shí)間，更換培養(yǎng)條件：將300萬(wàn)個(gè)孢子接種于100mL種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，接種量為5%，培養(yǎng)26～28h。培養(yǎng)溫度均為25℃，轉(zhuǎn)速為180r/min。菌體在培養(yǎng)基內(nèi)要維持生長(zhǎng)需要的足夠的碳，搖動(dòng)發(fā)酵液后，此時(shí)微生物代謝會(huì)進(jìn)入TCA循環(huán)，產(chǎn)生大量的能量供給微生物的生命活動(dòng)[10]。改變常見(jiàn)碳源的濃度梯度，或改變常見(jiàn)碳源的成分，將碳濃度設(shè)定為表3中數(shù)值。

使用表3中調(diào)控的碳源濃度，設(shè)定3種不同梯度碳源濃度，發(fā)酵期為6天，使用150mL的錐形瓶，裝取75mL混有3種不同濃度的碳源的培養(yǎng)液[11]。計(jì)算菌體濕重公式為

(1)

式中：W為菌體濕重；CS為培養(yǎng)基面積；FS為視野面積；Fn為每片計(jì)數(shù)過(guò)的視野數(shù)；V為1L水經(jīng)沉淀濃縮后的體積；v為計(jì)數(shù)框體積；Pn為每片通過(guò)計(jì)算實(shí)際數(shù)出的菌類個(gè)數(shù)[12]。

菌體干重的計(jì)算公式為

(2)

式中：M為菌體干重；x，y為培養(yǎng)基觀測(cè)位置；t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間；C為(x,y)處t時(shí)刻碳濃度；n為pH值大??；Dx為橫向彌散系數(shù)；Dy為縱向彌散系數(shù)[13]。

1.5.1 低碳源

將發(fā)酵液搖晃均勻后，取10mL置于布氏漏斗中，同時(shí)加入100mL去離子水沖洗，真空抽濾，水分抽濾干后將濾紙置于65℃烘箱中11h,烘干，然后置于干燥器中恒重24h，稱重，計(jì)算菌體干重。

1.5.2 中碳源

取發(fā)酵液750μL于2mL的離心管中，加入750μL發(fā)酵液與甲醛1∶1萃取后的溶液，混合均勻后，使用超聲波超聲提取5min，使用1mL注射器吸取溶液上部分清液，然后使用尺寸為0.45μm的濾頭過(guò)濾，用高效液相色譜測(cè)定菌體的干濕重。

1.5.3 高碳源

高碳源調(diào)控方法使用HPLC檢測(cè)，設(shè)定檢測(cè)條件為Kromasil-C18液相色譜柱，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260mm，流速為1mL/min，進(jìn)樣量為20μL，流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸和乙腈線性梯度洗脫。設(shè)置洗脫梯度為：0.01～30.00min，45%B相；30.00～35.00min，85%B相[14]。配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mg/L、25mg/L、55mg/L、95mg/L、125mg/L、225mg/L、325mg/L、425mg/L、525mg/L)，計(jì)算得到相峰積分，然后計(jì)算各個(gè)相峰面積，得到菌體干濕重大小。使用峰面積對(duì)碳濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(回歸系數(shù)R2=0.99)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式為

y=16.591x+8.9933

(3)

式中：其中回歸系數(shù)為R2=0.9998；x為時(shí)間，min[15]。

2 調(diào)控結(jié)果

2.1 低濃度調(diào)控結(jié)果

不同菌種類型會(huì)產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，而同一種菌種在產(chǎn)生代謝產(chǎn)物時(shí)，對(duì)應(yīng)最佳菌體的重量也不同，調(diào)控微生物轉(zhuǎn)化時(shí)，控制3種不同濃度的碳源，統(tǒng)計(jì)調(diào)控6天培養(yǎng)基，得到的低碳濃度的菌體干濕重變化見(jiàn)圖2。

圖2 低濃度碳源菌體干濕重變化

由圖2可知:控制低碳源濃度為0～35000mg/L時(shí)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，菌體濕重穩(wěn)步增長(zhǎng)，在約126h時(shí)，濕重開始減小，最終維持在38～40g之間。菌體在78h時(shí)，干重開始下降，但在90h時(shí)，又恢復(fù)穩(wěn)固上升的趨勢(shì)。

2.2 中濃度調(diào)控結(jié)果

維持中濃度碳源在7000～42000mg/L，隨著水分的蒸發(fā)，前幾個(gè)小時(shí)菌體生長(zhǎng)旺盛，菌液黏稠。將通氣調(diào)至最高，補(bǔ)加水增強(qiáng)控制菌的攝氧率，增強(qiáng)有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化代謝過(guò)程。中濃度碳源菌體干濕重變化見(jiàn)圖3。

圖3 中濃度碳源菌體干濕重變化

由圖3可知:維持中濃度碳源，在96h時(shí)，菌體濕重大小發(fā)生小轉(zhuǎn)折，但依舊保持上升趨勢(shì)；而此時(shí)的菌體干重并沒(méi)有發(fā)生明顯變化，最終維持在10g左右。

2.3 高濃度調(diào)控結(jié)果

增加碳源種類，將碳源濃度保持在21000～56000mg/L的高濃度區(qū)間內(nèi)，菌體在此濃度下，自體產(chǎn)生自行代謝，并產(chǎn)生大量的前體，此時(shí)的菌體干濕重量變化見(jiàn)圖4。

圖4 高濃度碳源菌體干濕重變化

由圖4可知:維持高濃度碳源，菌體在20h時(shí)，濕重逐漸增加，大小增長(zhǎng)到40g。而干重保持增長(zhǎng)，到120h時(shí)，干重大小變?yōu)?0g，之后干重減小，實(shí)驗(yàn)完畢后，菌體干重維持在10g左右。

3 結(jié) 論

3.1 保持低碳濃度環(huán)境

在培養(yǎng)基發(fā)酵后期，菌體生長(zhǎng)緩慢，殘?zhí)橇枯^低。維持正常代謝過(guò)程時(shí)需要足夠的碳骨架，碳骨架會(huì)產(chǎn)生代謝過(guò)程的關(guān)鍵中間體FGFC3，但在低碳濃度環(huán)境下的合成能力較低，所以代謝過(guò)程在72h時(shí)，F(xiàn)GFC3開始積累，才可以維持正常的代謝過(guò)程，調(diào)控方式基本奏效。在124h之后，由于殘?zhí)橇窟^(guò)低，培養(yǎng)基發(fā)酵液環(huán)境內(nèi)的pH值迅速升高，導(dǎo)致代謝所需的FGFC3無(wú)法正常產(chǎn)生，破壞了發(fā)酵體系。此時(shí)的菌體濕重、干重波動(dòng)較大，調(diào)控效果最明顯。

3.2 保持中濃度碳環(huán)境

在20h時(shí)，逐漸產(chǎn)生FGFC3，沒(méi)有出現(xiàn)二次積累，并隨著時(shí)間的持續(xù)積累呈現(xiàn)出一種小幅度的波動(dòng)變化。中碳濃度的調(diào)控環(huán)境，可以提供足夠的碳骨架，幫助產(chǎn)生更多的FGFC3。但剩下的中濃度碳源會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)，打破代謝平衡。隨著時(shí)間的增加，代謝會(huì)產(chǎn)生一種由正常代謝到打破正常代謝，最終又恢復(fù)正常代謝的循環(huán)過(guò)程，導(dǎo)致圖2中濕重不斷增加、干重基本保持不變的情況。調(diào)控效果不明顯，基本不影響水環(huán)境有機(jī)污染物微生物的轉(zhuǎn)化。

3.3 調(diào)節(jié)到高濃度碳環(huán)境

代謝過(guò)程中的酶會(huì)將鳥氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，瓜氨酸參與到代謝過(guò)程中反應(yīng)，轉(zhuǎn)換形成精氨琥珀酸，然后在酶的催化下，裂解水解后形成尿素，加快了代謝過(guò)程。所以在72h之后，殘?zhí)橇康?，高濃度的碳源?huì)合成更多的FGFC3，剩余的碳源會(huì)因?yàn)闈舛冗^(guò)高，經(jīng)干燥后增加了菌體的干重。在120h時(shí)，經(jīng)過(guò)干燥后的碳會(huì)變成區(qū)別于菌體的黑色固體，去除殘余的黑色碳，得到菌體干重大小變化。因此,高濃度調(diào)控環(huán)境，代謝調(diào)控效果一般。

4 結(jié) 語(yǔ)

在當(dāng)今蓬勃發(fā)展的社會(huì)，疏忽對(duì)環(huán)境的保護(hù)，會(huì)造成環(huán)境的污染。研究水環(huán)境有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化的代謝調(diào)控，可以更科學(xué)地治理被有機(jī)污染物污染的水環(huán)境，更加全面地研究水環(huán)境內(nèi)存在的有機(jī)污染物，有助于水環(huán)境的治理，使經(jīng)濟(jì)發(fā)展與環(huán)境發(fā)展相協(xié)調(diào)，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。