紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化

王 寧，楊繼業(yè)，陳書明，辛嘉英，宋 晶，張建新，王倩倩

紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化

王 寧1，楊繼業(yè)2，陳書明1※，辛嘉英3，宋 晶1，張建新1，王倩倩1

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801；2. 山西省畜牧遺傳育種中心，太原 030027；3. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點實驗室，哈爾濱 150076）

豆腐渣雖含有多種營養(yǎng)成分，但大約50%的干物質(zhì)是難以消化的纖維素及半纖維素，直接用作飼料，飼喂效果并不理想。為了提高豆腐渣的飼用價值，進(jìn)行了紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化研究。首先，在單因素試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗的結(jié)果顯示，優(yōu)化的豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝參數(shù)為：鹽酸濃度1.0 mol/L，料液比（g/mL）1∶10，酸解溫度100 ℃，酸解時間3.0 h，該條件下還原糖得率達(dá)29.06%±0.07%。然后，選用嗜還原糖紅酵母發(fā)酵富含還原糖的豆腐渣酸解產(chǎn)物，以產(chǎn)生具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種生物學(xué)功能的類胡蘿卜素。通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗回歸分析、Box-Behnken試驗及響應(yīng)面分析，獲得優(yōu)化的發(fā)酵工藝參數(shù)：發(fā)酵底物pH值 6.0，裝液量80 mL/(500 mL)，接種齡48 h，接種量11%（種子液濃度為8.5×109CFU/mL），轉(zhuǎn)速60 r/min，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間128 h；該條件下類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)（2.65±0.02）mg/L，比工藝優(yōu)化前產(chǎn)量提高了67.7%，研究結(jié)果可為利用廉價豆腐渣開發(fā)高附加值類胡蘿卜素功能飼料提供參考。

發(fā)酵；優(yōu)化；豆腐渣；酸解；還原糖；紅酵母；類胡蘿卜素

0 引 言

豆腐渣雖含有粗蛋白質(zhì)、粗脂肪等多種營養(yǎng)成分，但大約50%的干物質(zhì)是難以消化的纖維素及半纖維素，并含有胰蛋白酶抑制因子等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子。因此，用豆腐渣直接飼喂動物，動物不僅對其消化吸收率有限，而且會使動物對飼料營養(yǎng)吸收率降低，影響動物的生產(chǎn)性能[1-23]。為了提高豆腐渣的飼用價值，學(xué)者們進(jìn)行了大量研究。李艷芳等[4]利用黑曲霉和米曲霉發(fā)酵，使豆渣口感得以改善，使其渣感減弱，吞咽變易。Li等[5]利用茯苓發(fā)酵豆渣，使得多糖的產(chǎn)量達(dá)到了83.3 mg/g。申春莉等[6]利用靈芝固態(tài)發(fā)酵豆渣，使得總膳食纖維和脂肪均顯著下降，可溶性蛋白、氨基酸態(tài)氮和多肽均上升，改變了豆渣的營養(yǎng)成分。由此可見，微生物發(fā)酵不僅能改善豆渣的口感，還可改善其營養(yǎng)價值[7]。

類胡蘿卜素是一類含有8個異戊二烯單位的四萜類化合物，動物和人一般不能合成類胡蘿卜素，只能從飼料與食物中獲取。類胡蘿卜素具有很強(qiáng)的清除體內(nèi)自由基的能力，具有抗癌、抗衰老、預(yù)防輻射及心血管疾病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效，因而受到越來越多人的青睞[8]。獲取類胡蘿卜素的方法有3種：1）動植物材料提取法：是以各種有色植物以及蝦皮、蟹殼等為原料提取類胡蘿卜素，該法受季節(jié)、材料品種、生長環(huán)境等因素影響很大，而且工藝復(fù)雜，成本高；2）化學(xué)合成法：該法的缺點是化工合成過程中常會產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，因其安全性問題，該類產(chǎn)品越來越受到公眾的抵制；3）微生物發(fā)酵法：是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，是目前生產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳方法，而紅酵母是產(chǎn)類胡蘿卜素的常用菌種之一[8-9]。紅酵母發(fā)酵對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求簡單，發(fā)酵周期短，代謝產(chǎn)物無毒無害，且能合成大量類胡蘿卜素，故利用紅酵母發(fā)酵一些廉價的農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)類胡蘿卜素已成為近些年的研究熱點[10-14]。紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素傳統(tǒng)培養(yǎng)基組分為葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等，成本很高[15]；也有紅酵母發(fā)酵廉價農(nóng)副產(chǎn)品產(chǎn)類胡蘿卜素的報道，但由于這些廉價材料缺乏紅酵母發(fā)酵可利用的養(yǎng)分，常需要添加額外的碳源、氮源等物質(zhì)，使得生產(chǎn)成本提高[9,16-17]。豆腐渣雖然便宜且產(chǎn)量大，但其干物質(zhì)中約50%為紅酵母不能利用的纖維素及半纖維素[1,18]，關(guān)于紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素也鮮有報道。鑒于此，本研究以豆腐渣酸解為切入點，選用胃酸主要成分鹽酸，利用單因素試驗結(jié)合正交試驗的方法，先對豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，以解決嗜還原糖紅酵母不能利用豆腐渣纖維素及半纖維素，需要額外添加還原糖為碳源的技術(shù)瓶頸。然后，再采用單因素試驗、Plackett-Burman試驗回歸分析、Box-Behnken試驗及響應(yīng)面分析，優(yōu)化嗜還原糖紅酵母發(fā)酵富含還原糖豆腐渣酸解液產(chǎn)類胡蘿卜素的工藝。本研究可為利用廉價豆腐渣開發(fā)高附加值類胡蘿卜素功能飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紅酵母（）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實驗室保藏。豆腐渣：將太谷縣北沙河豆腐廠提供的豆腐渣烘至恒量，測得粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.64%，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.74%，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.73%，酸性洗滌纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.44%，中性洗滌纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.69%。

1.2 方法

紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化流程圖如圖1所示。

圖1 紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化流程圖

1.2.1 紅酵母培養(yǎng)基配方與種子液制備

紅酵母斜面培養(yǎng)基配方：葡萄糖15 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 1 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.54 g/L，瓊脂20 g/L，pH值 6.0。紅酵母液體種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，裝量50 mL/(250 mL)，pH值6.0。紅酵母種子液制備：從斜面培養(yǎng)基上挑取兩環(huán)紅酵母，接種于50 mL滅菌液體種子培養(yǎng)基中，30 ℃，60 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，用滅菌水調(diào)整紅酵母種子液濃度為8.5×109CFU/mL，備用。

1.2.2 豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝優(yōu)化

以豆腐渣酸解還原糖得率為檢測指標(biāo)，對鹽酸濃度、料液比、酸解溫度、酸解時間分別進(jìn)行單因素試驗，上述4因素梯度設(shè)計見表1，設(shè)計依據(jù)為文獻(xiàn)[8,19]以及前期預(yù)試驗結(jié)果。在做每個單因素試驗時，要保持另外3個因素不變。然后，基于上述單因素試驗篩選出的酸解最佳單因素參數(shù)，進(jìn)行L9（34）正交試驗，正交試驗因素與水平見表2，通過該試驗旨在獲得豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝參數(shù)優(yōu)化組合。

1.2.3 紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化

以類胡蘿卜素產(chǎn)量為檢測指標(biāo)，對紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液可能有影響的7個因素（見表3）進(jìn)行單因素試驗，試驗設(shè)計（表3）依據(jù)為前期預(yù)試驗結(jié)果。在做每個單因素試驗時，要保持另外6個因素不變。基于上述單因素試驗結(jié)果，再進(jìn)行Plackett-Burman試驗回歸分析[20]，試驗設(shè)計見表4，旨在篩選出影響紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液產(chǎn)類胡蘿卜素的主要因素。然后，以Plackett-Burman試驗篩選出的4個主要因素：豆腐渣酸解液pH值、紅酵母接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為自變量，類胡蘿卜素產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗（見表 5），優(yōu)化紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液產(chǎn)類胡蘿卜素工藝。

表1 豆腐渣酸解單因素試驗

表2 正交試驗因素與水平表

表3 紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液單因素試驗

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計

1.2.4 相關(guān)指標(biāo)測定方法

還原糖得率的測定：采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法[8]；類胡蘿卜素的測定：采用酸熱破壁-丙酮提取-比色法[8]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析、Duncan多重比較及獨立樣本檢驗，用Design-Expert 10.0進(jìn)行Plackett-Burman與Box-Behnken試驗設(shè)計，用GraphPad Prism 7.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗

由圖2a可知，隨著鹽酸濃度的增大，豆腐渣酸解還原糖得率先增加后減小。當(dāng)鹽酸濃度為1.0 mol/L時，還原糖得率最高，且與臨近檢測點數(shù)據(jù)差異顯著（<0.05）。在圖2b與圖2d中，豆腐渣酸解還原糖得率均呈現(xiàn)先升到最大值、再緩慢下降的趨勢。當(dāng)料液比（g/mL）為1∶10、酸解時間為3 h，還原糖得率均達(dá)最大值，且與臨近檢測點數(shù)據(jù)差異均顯著（<0.05）。由圖 2c可見，隨著酸解溫度的升高，豆腐渣酸解還原糖得率呈線性增加。由于常壓下水浴最高溫度為100 ℃，再提高溫度就需要高壓或油浴，使酸解工藝復(fù)雜化，并使成本大幅升高，故選擇100 ℃為最優(yōu)酸解溫度。

注：圖2a中，料液比（g·mL-1）1∶10，酸解溫度100 ℃，酸解時間3.0 h；圖2b中，鹽酸濃度1.0 mol·L-1，酸解溫度100 ℃，酸解時間3.0 h；圖2c中，鹽酸濃度1.0 mol·L-1，料液比（g·mL-1）1∶10，酸解時間3.0 h；圖2d中，鹽酸濃度1.0 mol·L-1，料液比（g·mL-1）1∶10，酸解溫度100 ℃。圖中相同小寫字母表示差異不顯著（P>0.05），不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），下同。

2.1.2 正交試驗

根據(jù)2.1.1單因素試驗篩選出的酸解最佳單因素參數(shù)，進(jìn)行L9（34）正交試驗，試驗結(jié)果見表6。比較表6極差（）大小可知，豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖影響因素作用大小排序為：鹽酸濃度（）、酸解溫度（）、酸解時間（）、料液比（）。再根據(jù)單因素K值的大小判斷最優(yōu)水平，K值最大的即為該單因素的最優(yōu)水平[21]，因此豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝參數(shù)優(yōu)化組合為2232。由于該組合不在表6正交試驗設(shè)計之內(nèi)，故對該組合進(jìn)行了驗證試驗，測得還原糖得率為29.06%±0.07%，顯著高于正交試驗表中最高還原糖得率28.91%±0.03%（<0.05），從而驗證了豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝參數(shù)優(yōu)化組合為2232，即鹽酸濃度1.0 mol/L，料液比（g/mL）1∶10，酸解溫度100 ℃，酸解時間3.0 h。

2.2 紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

由圖3可見，類胡蘿卜素產(chǎn)量變化均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當(dāng)7個單因素數(shù)值分別為發(fā)酵底物pH值6.0、裝液量80 mL/(500 mL)、接種齡48 h、接種量10%、轉(zhuǎn)速60 r/min、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間120 h，類胡蘿卜素產(chǎn)量分別達(dá)最大峰值，并且每個峰值與其臨近檢測點數(shù)據(jù)比較，均顯示差異顯著（<0.05）。

表6 正交試驗結(jié)果

2.2.2 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗回歸分析表明，該試驗設(shè)計模型的決定系數(shù)（2）為0.958 8，調(diào)整決定系數(shù)（2Adj）為0.845 3，試驗整體因素模型值為0.041＜0.05，說明整體模型對試驗結(jié)果有顯著影響，Plackett-Burman試驗結(jié)果具有可信度。對該模型進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，豆腐渣酸解液pH值、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對類胡蘿卜素產(chǎn)量影響最為顯著（<0.05），也就是說上述4因素是影響紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液產(chǎn)類胡蘿卜素的主要因素。因此選擇上述4個因素進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗

基于2.2.1單因素試驗與2.2.2 Plackett-Burman試驗的結(jié)果，固定裝液量80 mL/(500 mL)、接種齡48 h、轉(zhuǎn)速60 r/min，選取豆腐渣酸解液pH值（1）、接種量（2）、發(fā)酵溫度（3）、發(fā)酵時間（4）進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，試驗結(jié)果見表7。采用Design-Expert 10.0 軟件，對表7試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到類胡蘿卜素產(chǎn)量（）對編碼自變量1、2、3、4的二次多項回歸方程（1）。

=2.54+0.0401+0.0332+0.0723+0.0724

+0.01312-0.06013+0.01214+0.1623

+0.06024-0.01734-0.1412-0.1722-0.1032

-0.1342。（1）

注：圖3a中，裝液量80 mL·(500 mL)-1，接種齡48 h，接種量10%，轉(zhuǎn)速60 r·min-1，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間120 h；圖3b中，pH值 6.0，接種齡48 h，接種量10%，轉(zhuǎn)速60 r·min-1，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間120 h；圖3c中，pH值 6.0，裝液量80 mL·(500 mL)-1，接種量10%，轉(zhuǎn)速60 r·min-1，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間120 h；圖3d中，pH值 6.0，裝液量80 mL·(500 mL)-1，接種齡48 h，轉(zhuǎn)速60 r·min-1，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間120 h；圖3e中，pH值 6.0，裝液量80 mL·(500 mL)-1，接種齡48 h，接種量10%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間120 h；圖3f中，pH值 6.0，裝液量80 mL·(500 mL)-1，接種齡48 h，接種量10%，轉(zhuǎn)速60 r·min-1，發(fā)酵時間120 h；圖3g中，pH值 6.0，裝液量80 mL·(500 mL)-1，接種齡48 h，接種量10%，轉(zhuǎn)速60 r·min-1，發(fā)酵溫度30 ℃。

表7 Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)值

由表8回歸模型方差分析可知，模型值小于0.001，表明整體模型對試驗結(jié)果具有極顯著的影響，模型具有可信度。失擬項值為0.926 6（>0.05），失擬檢驗不顯著，表明模型選擇適當(dāng)。該模型的決定系數(shù)2=0.964 4、調(diào)整決定系數(shù)2Adj=0.928 7，表明該模型的擬合程度好，預(yù)測值和試驗值之間的相關(guān)性好、誤差小、可信度高。變異系數(shù)CV=1.75%，表明試驗的重復(fù)性較好，結(jié)果較精確。由此可見，該模型是可靠的，可用于紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化的理論預(yù)測。

表8 回歸模型方差分析

注：*表示差異顯著（<0.05）；**表示差異高度顯著（<0.01）；***表示差異極顯著（<0.001）。

Note: * means signifinant difference(<0.05); ** means highly signifinant difference(<0.01); *** means extremely signifinant difference(<0.001).

從模型回歸系數(shù)顯著性檢驗可知，影響類胡蘿卜素產(chǎn)量（）的4個主要因素作用大小排序為：3=4>1>2；兩因素交互作用對有顯著影響的包括13、23與24，其中2與3交互作用對有極顯著影響。為了直觀展現(xiàn)上述交互作用，利用Design-Expert 10.0 軟件，對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制了13、23與24交互作用對類胡蘿卜素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖（圖4）。

注：圖4a中接種量10%，發(fā)酵時間120 h；圖4b中發(fā)酵底物pH值6.0，發(fā)酵時間120 h；圖4c中發(fā)酵底物pH值 6.0，發(fā)酵溫度30 ℃。

圖4a表示pH值與發(fā)酵溫度的交互作用，當(dāng)固定接種量為10%，發(fā)酵時間為120 h時，類胡蘿卜素產(chǎn)量隨著pH值和發(fā)酵溫度的增大而逐漸增大，當(dāng)達(dá)到中心點后又逐漸降低。圖4b表示接種量與發(fā)酵溫度的交互作用，當(dāng)固定發(fā)酵底物pH值為6.0，發(fā)酵時間為120 h時，類胡蘿卜素產(chǎn)量隨接種量與發(fā)酵溫度變化而變化的趨勢同圖 4a。圖4c表示接種量與發(fā)酵時間的交互作用，當(dāng)固定發(fā)酵底物pH值為6.0，發(fā)酵溫度為30 ℃時，類胡蘿卜素產(chǎn)量隨接種量與發(fā)酵時間變化而變化的趨勢也與圖4a相同。

2.2.4 最優(yōu)工藝參數(shù)的確定與驗證

用2.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗建立的回歸模型，預(yù)測出紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液產(chǎn)類胡蘿卜素主要工藝參數(shù)優(yōu)化組合為：發(fā)酵底物pH值6.02，接種量10.88%，發(fā)酵溫度31.27 ℃，發(fā)酵時間127.96 h，在此條件下類胡蘿卜素產(chǎn)量預(yù)測值為（2.59±0.03）mg/L。為了便于操作，將上述優(yōu)化工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵底物pH值 6.0，接種量11%，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間128 h。經(jīng)過3次平行驗證試驗，測得類胡蘿卜素產(chǎn)量為（2.65±0.02）mg/L，與模型預(yù)測值無顯著差異（>0.05），從而驗證了該模型及優(yōu)化工藝參數(shù)的可靠性。由于紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液發(fā)酵條件優(yōu)化前（發(fā)酵底物pH值 6.0，接種量10%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間120 h），測得類胡蘿卜素產(chǎn)量為（2.16±0.06）mg/L，故紅酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化使類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了22.7%（<0.01）。在相同發(fā)酵條件下，紅酵母發(fā)酵未酸解豆腐渣（對照組），測得類胡蘿卜素產(chǎn)量為（1.58±0.01）mg/L；而紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解液，測得類胡蘿卜素產(chǎn)量為（2.65±0.02）mg/L，故紅酵母發(fā)酵豆腐渣工藝優(yōu)化使類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了67.7%（<0.01），從而進(jìn)一步驗證了本文優(yōu)化工藝的可行性。

3 討 論

紅酵母是一類以芽殖為主、形態(tài)構(gòu)造簡單的單細(xì)胞真菌，其代謝產(chǎn)物不僅無毒無害，而且包含不飽和脂肪酸、維生素及類胡蘿卜素等人和動物正常代謝必需營養(yǎng)物質(zhì)，其菌體蛋白還是優(yōu)質(zhì)飼料蛋白質(zhì)[22]。本研究團(tuán)隊將實驗室前期分離的紅酵母鑒定為，用該紅酵母發(fā)酵醋糟，使醋糟中粗蛋白質(zhì)含量與真蛋白質(zhì)含量分別提高了27.68%與36.04%，類胡蘿卜素產(chǎn)量為6.60 mg/kg，極大提高了醋糟的飼用價值[15]。

在中國，傳統(tǒng)豆制品生產(chǎn)年耗用大豆原料約600萬t，鮮豆渣年排放量約3 000萬t，后者含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，直接用來喂豬會降低飼料營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，造成豬只腹瀉，生產(chǎn)性能下降[18]。為使排放量巨大、價格低廉的豆腐渣的飼用價值得以提高，本團(tuán)隊進(jìn)行了紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素研究。

可利用碳源對酵母生長代謝至關(guān)重要，既為酵母細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)物質(zhì)，又為酵母生長代謝提供能量[23-24]。紅酵母易于利用的碳源是還原糖[17,25]，但豆腐渣中卻缺乏還原糖[3,8]，豆腐渣干物質(zhì)中約50%為紅酵母不能利用的纖維素及半纖維素[1,18]，而添加還原糖進(jìn)行紅酵母發(fā)酵又使得生產(chǎn)成本升高。因此，本研究首先以提高豆腐渣還原糖含量為目標(biāo)，選用胃酸主要成分鹽酸，利用單因素試驗結(jié)合正交試驗的方法，對豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝進(jìn)行了優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝參數(shù)優(yōu)化組合為：鹽酸濃度1.0 mol/L，料液比（g/mL）1∶10，酸解溫度100 ℃，酸解時間3.0 h，該條件下還原糖得率高達(dá)29.06%±0.07%。其機(jī)理可能是，在高溫條件下，豆腐渣粗纖維分子單糖殘基間的-1,4-糖苷鍵被鹽酸破壞，粗纖維分子聚合度降低，進(jìn)而形成低聚糖、二糖以及單糖[26-27]，故豆腐渣酸解液中還原糖含量得以大幅提升。然后，在富含還原糖的豆腐渣酸解液中，接種嗜還原糖紅酵母種子液，并進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化試驗。在單因素試驗、Plackett-Burman試驗回歸分析基礎(chǔ)上進(jìn)行的Box-Behnken試驗及響應(yīng)面分析結(jié)果表明，該發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化組合為：豆腐渣酸解液pH值 6.0，裝液量80 mL/(500 mL)，紅酵母接種齡48 h，接種量11%（種子液濃度為8.5×109CFU/mL），轉(zhuǎn)速60 r/min，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間128 h，在此條件下類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)（2.65±0.02）mg/L，比未進(jìn)行工藝優(yōu)化的對照組的類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了67.7%，該結(jié)果與文獻(xiàn)[17,23-25]報道的紅酵母培養(yǎng)基還原糖含量升高會提高類胡蘿卜素產(chǎn)量的試驗結(jié)果相吻合。

本研究的特色在于，當(dāng)發(fā)現(xiàn)豆腐渣中缺乏紅酵母發(fā)酵可利用的碳源時，本試驗設(shè)計沒有遵循常規(guī)添加額外碳源，而是選用高溫、短時間酸解約占豆腐渣干物質(zhì)50%、且不能被紅酵母利用的纖維素及半纖維素，使其轉(zhuǎn)化為紅酵母易于利用的還原糖，并且酸解工藝參數(shù)優(yōu)化控制恰到好處，因為豆腐渣酸解產(chǎn)物不但沒有對后續(xù)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響，而且極顯著提高了功能性發(fā)酵產(chǎn)物類胡蘿卜素的產(chǎn)量，解決了紅酵母發(fā)酵不能利用豆腐渣纖維素及半纖維素、需額外添加可利用碳源的技術(shù)瓶頸，并優(yōu)化了紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素的工藝，使功能性發(fā)酵產(chǎn)物類胡蘿卜素的產(chǎn)量極顯著提高。

由于紅酵母發(fā)酵會產(chǎn)生脂肪酶等多種消化酶[28]以及多種有營養(yǎng)的代謝產(chǎn)物，特別是會產(chǎn)生大量高營養(yǎng)酵母菌體蛋白[29]，故紅酵母發(fā)酵豆腐渣有望提高豆腐渣的飼用價值。紅酵母發(fā)酵究竟能改變豆腐渣的哪些營養(yǎng)成分有待后續(xù)研究。至于紅酵母發(fā)酵豆腐渣過程中還會產(chǎn)生哪些有益代謝產(chǎn)物，發(fā)酵產(chǎn)酶能否降解豆腐渣中的抗?fàn)I養(yǎng)因子等學(xué)術(shù)問題，也有待后續(xù)深入研究。本研究為利用廉價、低營養(yǎng)、排放量巨大的豆腐渣，開發(fā)高附加值、高營養(yǎng)的類胡蘿卜素功能飼料提供了參考。

4 結(jié) 論

1）豆腐渣酸解產(chǎn)還原糖工藝參數(shù)優(yōu)化組合為：鹽酸濃度1.0 mol/L，料液比（g/mL）1∶10，酸解溫度100 ℃，酸解時間3.0 h；該條件下，豆腐渣酸解還原糖得率達(dá)29.06%±0.07%。

2）用嗜還原糖紅酵母發(fā)酵富含還原糖豆腐渣酸解液，發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化組合為：豆腐渣酸解液pH 值6.0，裝液量80 mL/(500 mL)，紅酵母接種齡48 h，接種量11%（種子液濃度為8.5×109CFU/mL），轉(zhuǎn)速60 r/min，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間128 h；在此條件下，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)（2.65±0.02）mg/L，比未進(jìn)行工藝優(yōu)化的對照組的類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了67.7%。

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Optimization of the process for carotenoid production from bean curd residue fermented by

Wang Ning1, Yang Jiye2, Chen Shuming1※, Xin Jiaying3, Song Jing1, Zhang Jianxin1, Wang Qianqian1

(1.,,030801,; 2.,030027,;3.,,150076,)

Bean curd residue as livestock feed contains crude protein, crude fat and other nutrients. However, more than 50% contents in bean curd residue are the indigestible dry matters (mainly cellulose and hemicellulose), while the absorption of nutrients can also be interfered by the trypsin inhibitor and other anti-nutritional factors. Consequently, the specific pretreatment of bean curd residue can increase the digestibility, absorption rate, utilization of feed nutrients, and the production performance of livestock and poultry. In order to improve the feeding value of bean curd residue, this study aims to explore an optimization technology for carotenoid production from the fermented bean curd residue by. Firstly, the yield of reducing sugar was taken as the index in the acidolysis solution of bean curd residue, while a single factor test was carried out on four factors: hydrochloric acid concentration, solid-liquid ratio, acidolysis temperature and acidolysis time. In L9(34) orthogonal test, the optimal combination of parameters for the yield of reducing sugar from bean curd residue by acidolysis was as following: hydrochloric acid concentration was 1.0 mol/L, solid-liquid ratio (g/mL) was 1:10, acidolysis temperature was 100 ℃, and acidolysis time was 3.0 h. At this condition, the yield of reducing sugar reached 29.06%±0.07% in the optimal acidolysis solution of bean curd residue.was selected to ferment the acidolysis solution of bean curd residue rich in reducing sugar, and thereby produce functional nutrient carotenoids. The yield of carotenoid was taken as the indictor, and the single factor test was carried out on 7 factors, such as fermentation temperature and time, which can affect the fermentation of acidolysis solution of bean curd residue by. In the single factor test, Plackett-Burman test regression was used to screen out the main influencing factors. The results showed that the main factors influencing the yield of carotenoid were the pH value of the acidolysis solution of bean curd residue, inoculum amount of, fermentation temperature and fermentation time. Three levels of Box-Behnken response surface test were designed to optimize the four main factors as independent variables, and the yield of carotenoid as the response value. The optimal combination of technological parameters was obtained: the pH value of the fermented acidolysis solution of bean curd residue was 6.0, liquid volume was 80 mL/ (500 mL), inoculation age was 48 h, inoculation amount was 11% (the concentration of seed liquid was 8.5×109CFU/mL), rotation speed was 60 r/min, fermentation temperature was 31℃, fermentation time was 128 h. In this case, the yield of carotenoids reached (2.65±0.02) mg/L, which was 67.7% higher than that by non-optimized fermentation techniques.In, there wereonly simple nutrient requirements, including short fermentation cycle, non-toxic metabolites, easy to synthesize plentiful carotenoid in a short period of time. Carotenoid can serve as antioxidant to enhance immunity, thereby to prevent cardiovascular and cerebrovascular diseases, and cancer.Therefore, the deep-processing is expected that the bean curd residue can be translated into carotenoid functional feed with high value-added and nutrition. The optimized technique for carotenoid production from the fermented bean curd residue bycan provide a promising prospect and remarkable potential market for livestock feed.

fermentation; optimization; bean curd residue; acidolysis; reducing sugar;; carotenoid

王寧，楊繼業(yè)，陳書明，等. 紅酵母發(fā)酵豆腐渣產(chǎn)類胡蘿卜素工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2020，36(9)：323-330.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.09.037 http://www.tcsae.org

Wang Ning, Yang Jiye, Chen Shuming, et al. Optimization of the process for carotenoid production from bean curd residue fermented by[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(9): 323-330. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.09.037 http://www.tcsae.org

2019-12-18

2020-04-24

山西省重點研發(fā)計劃項目（201903D221013、201603D221027-3）；山西省優(yōu)秀人才科技創(chuàng)新項目（201705D211029）；晉中市科技攻關(guān)項目（N1612）；國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-38）

王寧，研究方向為動物細(xì)胞分子調(diào)控與生物工程。Email：wangning950203@163.com

陳書明，教授，研究方向為動物細(xì)胞分子調(diào)控與生物工程。Email：13834834183@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.09.037

S816.9

A

1002-6819(2020)-09-0323-08