IOS和MOS對(duì)牦牛肌原纖維蛋白生化與功能特性的影響

張 麗，王惠惠，宋艷艷，魏晉梅，余群力，韓 玲

IOS和MOS對(duì)牦牛肌原纖維蛋白生化與功能特性的影響

張 麗1，王惠惠1，宋艷艷1，魏晉梅2，余群力1，韓 玲1

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

氧化是調(diào)控肉類品質(zhì)的一種潛在工具，肉類蛋白氧化調(diào)控理論的完善有助于其在食品工程中的應(yīng)用。為了研究不同氧化體系下，牦牛肌原纖維蛋白化學(xué)修飾與功能性質(zhì)之間關(guān)系，該研究分析了離子氧化體系（Iron Oxidizing System，IOS）和高鐵肌紅蛋白（Metmyoglobin Oxidizing System，MOS）氧化體系下在特定氧化程度（蛋白羰基含量）下牦牛肌原纖維蛋白的生化特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著氧化強(qiáng)度的提升，牦牛肌原纖維蛋白會(huì)發(fā)生顯著的巰基喪失、二硫鍵生成、二酪酸增加以及表面疏水性下降現(xiàn)象（<0.05）。當(dāng)羰基濃度達(dá)到（1.51±0.13） nmol/mg以后，MOS體系的二硫鍵和表面疏水性變化比IOS系統(tǒng)更明顯。此外，隨著氧化程度的增加，-螺旋結(jié)構(gòu)比例會(huì)持續(xù)減少，而-折疊與-轉(zhuǎn)角結(jié)夠會(huì)持續(xù)增加。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)功能性功能性研究，還發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)难趸瘜?duì)牦牛肌原纖維蛋白的溶解性和乳化性有一定改善作用，其改善峰值和范圍因氧化體系不同而有所差異，MOS的功能特性影響對(duì)氧化強(qiáng)度更敏感。通過(guò)相關(guān)性分析可以發(fā)現(xiàn)，二硫鍵與溶解度、濁度、乳化性等功能特性相關(guān)性顯著，二級(jí)結(jié)構(gòu)大多數(shù)指標(biāo)則與溶解性和濁度相關(guān)性顯著。綜上所述，不同氧化體系對(duì)于肌原纖維蛋白的生化及功能特性的影響存在差異，MOS系統(tǒng)能夠在較小的氧化程度下對(duì)功能特性產(chǎn)生改善作用，這與其同時(shí)帶來(lái)的二硫鍵和表面疏水性更顯著的變化有關(guān)。

肉；氧化；生物化學(xué)；牦牛；肌原纖維蛋白；功能特性

0 引 言

肌原纖維蛋白的氧化型化學(xué)修飾會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化、巰基喪失、二硫鍵或二酪酸交聯(lián)結(jié)構(gòu)的形成等一系列化學(xué)修飾現(xiàn)象以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變[1-2]，Estévez[3]指出這些結(jié)構(gòu)變化將通過(guò)強(qiáng)化蛋白質(zhì)空間網(wǎng)絡(luò)以及改變水解敏感性等途徑影響肌原纖維蛋白的功能性質(zhì)。研究表明適當(dāng)程度的氧化可能通過(guò)改變肌原纖維蛋白的表面疏水性，從而提高其水解敏感性而改善肉類嫩度[4]；同時(shí)較強(qiáng)的氧化則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的蛋白質(zhì)交聯(lián)提高肉制品硬度，然而這種交聯(lián)對(duì)于凝膠類肉制品（香腸、火腿、肉丸等）而言則意義重大[5]。因此，Lund等[6]認(rèn)為人工氧化干預(yù)將在肉制品品質(zhì)調(diào)控工程化方面的應(yīng)用極具潛力。

引起肌肉蛋白氧化的內(nèi)在體系主要是金屬離子催化氧化系統(tǒng)（Iron Oxidizing System，IOS）和高鐵肌紅蛋白氧化系統(tǒng)（Metmyoglobin Oxidizing System，MOS），不同系統(tǒng)引起的肌肉蛋白氧化現(xiàn)象有所不同[7]。Park等[8]報(bào)道稱MOS能夠在H2O2濃度相同的情況下（IOS與MOS體外孵化體系中均使用H2O2作為氧化劑）產(chǎn)生比IOS體系更多的蛋白質(zhì)羰基，而IOS則能夠形成更多的二硫鍵結(jié)構(gòu)。Xiong等[9]發(fā)現(xiàn)，MOS比IOS對(duì)氧化劑濃度更敏感。Estévez等[10]發(fā)現(xiàn)同等濃度的H2O2分別在IOS系統(tǒng)和MOS系統(tǒng)中都能夠令肌肉當(dāng)中的肌紅蛋白發(fā)生羰基化現(xiàn)象，而MOS系統(tǒng)的效果更為明顯。然而，不同氧化體系造成的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)差異及其與功能性質(zhì)之間的關(guān)系較少有研究報(bào)道。因此，闡明氧化體系差異對(duì)肌原纖維蛋白生化與功能性的影響有助于完善氧化調(diào)控肉質(zhì)的工程理論及應(yīng)用。

牦牛是中國(guó)青藏高原地區(qū)特有的優(yōu)勢(shì)畜種，牦牛肉顏色深紅，富含鐵元素和肌紅蛋白，儲(chǔ)藏加工過(guò)程中易受氧化影響。該研究為了不同氧化體系下牦牛肌原纖維蛋白化學(xué)修飾與功能性質(zhì)之間關(guān)系，在通過(guò)IOS和MOS這2種氧化體系對(duì)牦牛肌原纖維進(jìn)行體外孵化，并研究其生化及功能性質(zhì)的變化，以期為氧化調(diào)控肉質(zhì)的工程應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉來(lái)源：研究所用牦牛來(lái)自于甘肅省甘南自然放牧下健康無(wú)病、3～4歲左右體質(zhì)量約300±50 kg的9頭公牦牛，在商業(yè)屠宰廠夏河縣安多畜牧產(chǎn)業(yè)園進(jìn)行屠宰。宰后30 min內(nèi)取第12至第13肋骨處的背最長(zhǎng)肌（約100 g），剔除表面筋膜、脂肪，切成10 g大小肉塊，用錫箔紙包裹，液氮貯藏，用于肌原纖維蛋白的提取。來(lái)自9頭牦牛的肉塊隨機(jī)分為3個(gè)批次，每個(gè)批次所有肉塊提取得到的肌原纖維蛋白混合在一起，用于下述8個(gè)處理組，每個(gè)批次即為試驗(yàn)的一次重復(fù)（=3）。

主要試劑：2,4-二硝基苯肼（DNPH），國(guó)藥集團(tuán)，分析純；乙二胺四乙酸（EDTA）國(guó)藥集團(tuán)，分析純；過(guò)硫酸銨國(guó)藥集團(tuán)，分析純；維生素E國(guó)藥集團(tuán)，分析純；1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES），美國(guó)Sigma公司，分析純；肌紅蛋白，北京Solarbio公司，分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5500PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器有限公司；XHF-DY高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 具體試驗(yàn)方法

肌原纖維蛋白提?。簠⒖糥iong等[9]的方法并略作修改。稱取1g肉樣，加4 mL提取液（10 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH值7.0）勻漿，離心（2 000×g，15 min），棄上清液，重復(fù)2次，條件同上。沉淀用4倍體積（體積質(zhì)量比）100 mmol/LNaCl溶液制成懸濁液后，再次離心（2 000×g，15 min），棄上清液，重復(fù)2次，并在最后1次離心前用100目濾布過(guò)濾以除去結(jié)締組織，并將其pH值用0.1 mol/L HCl調(diào)至6.0。將提取的肌原纖維蛋白貯存于0 ℃條件下，在24 h內(nèi)使用。

高鐵肌紅蛋白制備：參考Liu等[11]的方法略作修改。將肌紅蛋白用磷酸鈉緩沖液（2.0 mmol/L，pH值7.0）溶解，加入鐵氰化鉀氧化，4℃條件用磷酸鈉緩沖液透析至透析液無(wú)色后，分別測(cè)定525、545、565、572 nm波長(zhǎng)處的紫外吸光度（分別計(jì)作525、545、565、572），并根據(jù)公式（1）計(jì)算高鐵肌紅蛋白（MetMb）含量，公式（1）中1、2、3分別指572 nm/525 nm、565 nm/525 nm、545 nm/525 nm，所得高鐵肌紅蛋白貯藏于-80 ℃冰箱備用。

MetMb（%）=（-2.5141+0.777R2+ 0.8003 +1.098) × 100）（1）

建立氧化體系：參考Xiong等[9]的方法建立IOS和MOS氧化體系，并略作修改。所涉及2種氧化體系又分為3個(gè)氧化程度水平，分別計(jì)作低、中、高水平。根據(jù)Estévez[3]的研究，當(dāng)肌原纖維蛋白氧化產(chǎn)生的羰基增量達(dá)到4 nmol/mg時(shí)，肌原纖維蛋白會(huì)發(fā)生非常嚴(yán)重的交聯(lián)現(xiàn)象，從而引起功能特性極其明顯的劣變，該研究旨在研究氧化作為牦牛肉制品的品質(zhì)改良工具的可能性，因此在該研究中設(shè)定羰基增量在1.5 nmol/mg以下（實(shí)際為1.22 nmol/mg）。因此，該研究通過(guò)預(yù)試驗(yàn)調(diào)整參數(shù)。為確保每個(gè)水平下2種氧化體系孵化培養(yǎng)的牦牛肌原纖維蛋白羰基含量無(wú)顯著差異（>0.05）。IOS體系具體為0.01 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸以及H2O2濃度分別為0.3、0.4、0.5 mmol/L的PIPES緩沖液（15 mmol/ LPIPES，0.6 mmol/LNaCl，pH值6.0），分別計(jì)為IOSL、IOSM、IOSH試驗(yàn)組。MOS體系具體為H2O2濃度及高鐵肌紅蛋白濃度均為0.1、0.3、0.5 mmol/L的PIPES緩沖液（15 mmol/LPIPES，0.6 mmol/L NaCl，pH值6.0），分別計(jì)為MOSL、MOSM、MOSH試驗(yàn)組。

體外孵化試驗(yàn)：將提取的肌原纖維蛋白分散于上述2個(gè)氧化體系的6個(gè)試驗(yàn)組當(dāng)中，組成體外反應(yīng)體系，通過(guò)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，最終蛋白質(zhì)濃度控制在（15±0.5） mg/mL。然后將反應(yīng)體系置于4 ℃條件下孵育24 h，然后使用1 mmol/LTrolox/EDTA終止反應(yīng)，4 ℃條件下離心（2 000×g，15 min），棄上清液，沉淀用5倍體積（體積質(zhì)量比）15 mmol/LPIPES緩沖液（無(wú)NaCl，pH值7.0）再次制成懸濁液，4 ℃條件下離心（2 000×g，15 min），棄上清液，重復(fù)2次充分去除氧化劑。另外進(jìn)行2組試驗(yàn)，將肌原纖維蛋白分散于PIPES緩沖液（15 mmol/L PIPES，0.6 mmol/LNaCl，pH值6.0），重復(fù)上述試驗(yàn)，分別作為IOS和MOS無(wú)氧化的對(duì)照組（分別計(jì)作IOSN和MOSN）。經(jīng)過(guò)氧化的肌原纖維蛋白樣本用于分析化學(xué)指標(biāo)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)功能特性。

1.4 化學(xué)指標(biāo)測(cè)定方法

巰基含量：根據(jù)Liu等[11]的方法，采用DTNB法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定3次取平均值。

二硫鍵含量：根據(jù)Thannhauser等[12]的方法，采用NTSB法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定3次取平均值。

二酪酸含量：參考李亮等[13]的方法，并略作修改。用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L KCl，pH值6.0）將經(jīng)過(guò)孵化后的肌原纖維蛋白制成懸濁液，并用雙縮脲法監(jiān)測(cè)濃度，將懸濁液蛋白濃度調(diào)整至1 mg/mL，過(guò)雙縮脲法測(cè)定被溶解的蛋白濃度。利用熒光光度法分析二酪酸含量（發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為325 nm），以吸光值除以蛋白濃度作為最終二酪酸含量（相對(duì)熒光值，AU），測(cè)定3次取平均值。

表面疏水性：參考Chelh等[14]的方法，并略作修改，取肌原纖維蛋白，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/LKCl，pH值6.0）制成懸濁液（蛋白濃度1 mg/mL）。取懸濁液2 mL，加入80g的溴酚藍(lán)，室溫?cái)嚢?0 min，離心后（6 000×g，10 min），取上清液，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L KCl，pH值6.0）稀釋10倍，在595 nm下測(cè)定吸光度（樣品），以磷酸鹽緩沖液作為空白（空白），根據(jù)公式（2）計(jì)算表面疏水性，測(cè)定3次取平均值。

表面疏水性=80g×（樣品-空白）÷空白（2）

1.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法

參考李可等[15]的方法，并略作修改。經(jīng)氧化的肌原纖維蛋白，凍干后取取1 mg與150 mg KBr混合，研磨后粉末放入壓片機(jī)中制樣。使用傅里葉變換紅外光譜儀分析光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)機(jī)器自帶的軟件進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)峰擬合，計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)-螺旋、-轉(zhuǎn)角、-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的百分比。每個(gè)樣品進(jìn)行6次掃譜，結(jié)果取平均值。

1.6 蛋白質(zhì)功能特性測(cè)定方法

溶解度：用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/LNaCl，pH值6.25）將肌原纖維蛋白制成2.5mg/mL的懸濁液。4 ℃條件下靜置1 h后，進(jìn)行離心（2 000×g，20 min），取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按照公式（3）計(jì)算溶解度，測(cè)定重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

溶解度=離心后上清液蛋白濃度÷離心前蛋白濃度×100% （3）

濁度：取剛剛配制的上述2.5 mg/mL肌原纖維蛋白懸濁液，置于室溫下20 min，在340 nm處測(cè)定吸光度值，以此計(jì)作濁度。測(cè)定重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

乳化性及乳化穩(wěn)定性：用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.5）將肌原纖維蛋白制成1 mg/mL的懸濁液，將5.0 mL大豆油和20 mL懸濁液放入直徑為50 mL的塑料離心管中。高速勻漿后（10 000 r/min，1 min），立即從距離心管底0.5 cm的地方取乳濁液50L（其余乳濁液備用），加入到5 mL 0.1%的SDS溶液中振蕩混勻，靜置10 min，500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值記作0。將備用乳濁液靜置10 min后，按照上述取樣及處理方法，再次測(cè)定吸光度計(jì)作10。根據(jù)公式（4）計(jì)算乳化活性（Emulsifying activity EAI），其中為蛋白質(zhì)濃度1 mg/mL，為油相體積分?jǐn)?shù)（即油的體積/乳濁液體積）；根據(jù)公式（5）計(jì)算乳化穩(wěn)定性（End System Identifier ESI）。測(cè)定重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

EAI=(2×2.303) ÷ [×(1-)]×0（4）

ESI=10÷0×100% （5）

起泡性及泡沫穩(wěn)定性：用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.0）將肌原纖維蛋白制成1 mg/mL的懸濁液，取20 mL懸濁液加入到50 mL的塑料離心管中，高速勻漿后（10 000 r/min，1 min），測(cè)定泡沬的體積0，靜置30 min后測(cè)定泡沫的體積30。根據(jù)公式（6）計(jì)算起泡性，根據(jù)公式（7）計(jì)算泡沫穩(wěn)定性，其中是泡沫形成前初始液的體積20 mL。測(cè)定重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

起泡性=0÷×100% （6）

泡沫穩(wěn)定性=30÷0×100% （7）

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，采用單因素方差分析同等氧化水平下不同氧化體系之間、同一氧化體系下不同氧化水平之間的數(shù)據(jù)顯著性差異，并同時(shí)使用GLM模型分析氧化體系因素和氧化水平因素影響的顯著性水平。并通過(guò)皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析牦牛肌原纖維蛋白功能特性與蛋白質(zhì)化學(xué)指標(biāo)及二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化體系對(duì)牦牛肌原纖維蛋白化學(xué)指標(biāo)的影響

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)所得參數(shù)，控制氧化水平，不同氧化體系的同等氧化水平下肌原纖維蛋白的羰基含量沒(méi)有顯著差異（>0.05），如表1所示。

表1 肌原纖維蛋白氧化體系（N=3）

注：氧化反應(yīng)體系基質(zhì)為PIPES緩沖液（15mmol·L-1PIPES，0.6 mmol·L-1NaCl，pH值6.0）。

Note: The substrate of oxidation reaction system is PIPES buffer (15mmol·L-1PIPES，0.6 mmol·L-1NaCl, pH value 6.0).

不同氧化體系作用后牦牛肌原纖維蛋白的巰基、二硫鍵、二酪酸含量以及表面疏水性如表2所示。由表可知，隨著氧化水平的提升，巰基含量顯著減少，并且二硫鍵含量顯著提升（<0.05）；但是在相同氧化水平下，不同氧化體系的巰基含量并差異不顯著（>0.05），當(dāng)氧化程度達(dá)到中和高時(shí)，即羰基含量分別為（1.51±0.13）和（2.20±0.11） nmol/mg，MOS體系下產(chǎn)生的二硫鍵顯著高于IOS體系，這說(shuō)明在MOS體系中，牦牛肌原纖維蛋白更容易形成二硫鍵交聯(lián)。二酪酸交聯(lián)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生同樣會(huì)隨著氧化程度的增加而顯著提升，但不同氧化體系體系在相似氧化強(qiáng)度下的二酪酸含量差異不顯著（>0.05）。在2種氧化體系下，牦牛肌原纖維蛋白的表面疏水性都會(huì)因氧化而顯著下降（<0.05），不同的是在IOS氧化體系下，當(dāng)羰基含量（1.19±0.06） nmol/mg以后表面疏水性即不再隨著氧化強(qiáng)度的提升而顯著下降，而MOS則是在羰基含量達(dá)到（1.51±0.13） nmol/mg的水平以后才會(huì)如此。通過(guò)GLM分析也可以發(fā)現(xiàn)，體系和強(qiáng)度的交互作用因素對(duì)二硫鍵和表面疏水性有顯著影響（<0.05），這說(shuō)明氧化強(qiáng)度對(duì)其變化的影響會(huì)因氧化體系差異而有所不同。由此可見(jiàn)，氧化強(qiáng)度會(huì)顯著影響牦牛肌原纖維蛋白的生化特性，而對(duì)于二硫鍵的生成以及表面疏水性的變化而言，MOS體系比IOS體系對(duì)氧化強(qiáng)度更加敏感。

2.2 氧化體系對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

不同氧化體系作用后牦牛肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如表3所示。隨著氧化水平的提升，-螺旋結(jié)構(gòu)比例會(huì)逐漸降低，對(duì)于對(duì)照組羰基含量提高了1.22 nmol/mg達(dá)到高水平時(shí)，-螺旋結(jié)構(gòu)將減少約17%，同時(shí)-折疊結(jié)構(gòu)的比例顯著提升了約13.5%（<0.05）。如前所述，隨著氧化的程度的增加同時(shí)發(fā)生了表面疏水性的降低，這與-螺旋結(jié)構(gòu)的減少和-折疊結(jié)構(gòu)的增加同步發(fā)生，結(jié)構(gòu)變化和表面疏水性的變化可能存在一定的關(guān)聯(lián)，這也許與-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)中R基團(tuán)的暴露方式差異有關(guān)。而隨著氧化程度的增加，-轉(zhuǎn)角略有增加，這與-折疊的大量增多是一致的，當(dāng)有一大段-折疊結(jié)構(gòu)出現(xiàn)時(shí)，在其一端就有相應(yīng)的-轉(zhuǎn)角出現(xiàn)以實(shí)現(xiàn)片段的折疊。氧化對(duì)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的比例沒(méi)有顯著影響（>0.05）。此外，牦牛肌原纖維蛋白的各種二級(jí)結(jié)構(gòu)比例均不受氧化體系差異的顯著影響（>0.05）。

表2 氧化體系對(duì)牦牛肌原纖維蛋白生化指標(biāo)的影響（N=3）

注：無(wú)氧化的羰基含量為0.98±0.09nmol·mg-1，低氧化為1.19±0.06 nmol·mg-1，中氧化為1.51±0.13 nmol·mg-1，高氧化為2.20±0.11 nmol·mg-1；同列不同大寫(xiě)字母代表同一氧化水平下不同氧化體系之間差異顯著（<0.05）；同行不同小寫(xiě)字母代表同一氧化體系下不同氧化水平之間差異顯著（<0.05）；值中，S代表氧化體系因素的影響，D代表氧化程度的影響，I代表交互作用影響，下同。

Note: Carbonyl content of no oxidation is 0.98±0.09 nmol·mg-1; low oxidation is 1.19±0.06 nmol·mg-1; media oxidation is 1.51±0.13 nmol·mg-1; high oxidation is 2.20±0.11 nmol·mg-1. Different capital letters in the same column indicate that means are significantly different (<0.05) between different oxidation systems under same oxidation degree; different lowercase letters in the same row indicate that means are significantly different (<0.05) between different oxidation degree under same. oxidation system. S is oxidation system; D is oxidation degree; I is interaction, the same below.

表3 氧化體系對(duì)牦牛肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響（N=3）

2.3 氧化體系對(duì)肌原纖維蛋白功能特性的影響

不同氧化體系對(duì)牦牛肌原纖維蛋白的功能特性如表 4所示。蛋白溶解度隨著氧化程度的增加出現(xiàn)了先增加后減小的規(guī)律，溶解度峰值出現(xiàn)在中水平，即羰基含量（1.51±0.13） nmol/mg，當(dāng)氧化程度達(dá)到中水平后，MOS體系的溶解度顯著高于IOS體系，這說(shuō)明MOS體系下的溶解度變化對(duì)氧化強(qiáng)度更加敏感。濁度在氧化程度達(dá)到高水平之前，IOS與MOS之間差異不顯著（>0.05），達(dá)高水平，即羰基（2.20±0.11） nmol/mg時(shí)，MOS的濁度顯著高于IOS（<0.05）。牦牛肌原纖維蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性表現(xiàn)出與溶解度類似的規(guī)律，都會(huì)隨著氧化程度的提高出現(xiàn)先增加后減少的規(guī)律，而且對(duì)于2種氧化體系而言，其敏感性明顯不同，IOS的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的峰值出現(xiàn)在中水平，即羰基含量（1.51±0.13） nmol/mg，而MOS的峰值則出現(xiàn)在低水平，即羰基含量（1.19±0.06） nmol/mg時(shí)，可見(jiàn)適當(dāng)?shù)难趸瘜?duì)牦牛肌原纖維蛋白的乳化能力有所改善，而不同氧化體系的改善程度及范圍均有所差異。由于在二硫鍵、表面疏水性變化、溶解度、乳化性方面，都表現(xiàn)出MOS系統(tǒng)對(duì)氧化程度更敏感的規(guī)律，這表明出肌原纖維蛋白溶解和乳化功能性變化可能與氧化誘導(dǎo)的二硫鍵形成和表面疏水性改變有關(guān)。牦牛肌原纖維蛋白的起泡性會(huì)因?yàn)檠趸档?，達(dá)到低水平，即羰基（1.19±0.06） nmol/mg時(shí)，起泡性就趨于穩(wěn)定了，不會(huì)再隨著氧化程度的提高而下降，這可能與牦牛肌原纖維蛋白的起泡性本身就低有關(guān)，繼續(xù)氧化也無(wú)法破壞蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)起泡性。此外，泡沫穩(wěn)定性在IOS系統(tǒng)中不受氧化程度顯著影響（>0.05），在MOS系統(tǒng)中則會(huì)隨氧化程度增加而顯著降低（<0.05），這說(shuō)明泡沫穩(wěn)定性同樣是在MOS系統(tǒng)中對(duì)氧化程度更敏感。

牦牛肌原纖維蛋白的功能特性與化學(xué)指標(biāo)及二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系如表5所示，通過(guò)相關(guān)性分析可以發(fā)現(xiàn)，二硫鍵與溶解度、濁度、乳化性等功能特性相關(guān)性顯著，二級(jí)結(jié)構(gòu)（除無(wú)規(guī)則卷曲）則與溶解度和濁度相關(guān)性顯著。

表4 氧化體系對(duì)牦牛肌原纖維蛋白功能特性的影響（N=3）

表5 牦牛肌原纖維蛋白功能特性與化學(xué)指標(biāo)及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)性

注：*代表相關(guān)性顯著（<0.05），**代表相關(guān)性極顯著（<0.01）。

Note: * indicates significant correlation (<0.05); ** indicates extremely significant correlation (<0.01).

3 討 論

該研究發(fā)現(xiàn)，IOS和MOS之間存在顯著差異的指標(biāo)包括二硫鍵、表面疏水性、溶解度和乳化活性，且MOS系統(tǒng)表現(xiàn)出對(duì)氧化強(qiáng)度更強(qiáng)烈的敏感性。Xiong等[9]研究了不同氧化體系下肌原纖維蛋白的巰基損失、二酪酸生成、氧化程度變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MOS比IOS對(duì)氧化劑濃度更敏感，這與該研究結(jié)果類似，所不同的是，該研究根據(jù)預(yù)試驗(yàn)反饋調(diào)控試驗(yàn)參數(shù)，將試驗(yàn)組的最終氧化程度（羰基含量）設(shè)定為同等水平，旨在分析同等氧化水平下不同氧化系統(tǒng)的表現(xiàn)是否存在差異。Park等[8]報(bào)道稱H2O2濃度相同時(shí)，IOS系統(tǒng)處理的肌原纖維蛋白產(chǎn)生了更多二硫鍵結(jié)構(gòu)；該研究則發(fā)現(xiàn)在氧化程度（羰基含量）相同的情況下，MOS可以產(chǎn)生顯著更多的二硫鍵結(jié)構(gòu)，看似雖然矛盾，但卻是從2個(gè)不同的方向來(lái)描述問(wèn)題，其存在差異的原因在于氧化劑水平盡管可能相同，但不同氧化系統(tǒng)孵化肌原纖維蛋白可能會(huì)產(chǎn)生不同的氧化程度。此外，李銀[16]研究了IOS對(duì)豬肌原纖維蛋白的影響，同樣發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度的提高豬肌原纖維蛋白的巰基顯著下降，但其表面疏水性卻顯著提升，這一點(diǎn)與該研究所發(fā)現(xiàn)牦牛表面疏水性的顯著下降不同，這可能與氧化程度差異以及牦牛肉與豬肉肌原纖維蛋白本身的差異有關(guān)；崔文斌[17]分析了不同氧化體系對(duì)牦牛肉肌原纖維蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)了與該研究類似的結(jié)果，但卻發(fā)現(xiàn)不同氧化體系對(duì)于二硫鍵生成的敏感性沒(méi)有顯著差異，這可能是因?yàn)檠趸瘡?qiáng)度設(shè)置的差異與該研究不同。

該研究通過(guò)預(yù)試驗(yàn)將氧化程度設(shè)定為固定水平，在同等氧化水平上分析不同氧化體系的差異，正是氧化系統(tǒng)本身的差異，盡管相同濃度的某氧化劑在不同氧化體系中可能會(huì)產(chǎn)生不同的作用。IOS系統(tǒng)中，F(xiàn)e3+可以從O2或H2O2獲得活性電子形成自由基，從而引發(fā)蛋白質(zhì)的氧化[18-19]；MOS系統(tǒng)中，H2O2可以將肌紅蛋白激發(fā)成超鐵肌紅蛋白（MbFe IV），這是一種能夠激發(fā)蛋白氧化的高活性自由基[20]。該研究發(fā)現(xiàn)MOS系統(tǒng)對(duì)氧化強(qiáng)度更加敏感，相關(guān)研究也有大量類似發(fā)現(xiàn)，Park等[21]研究了高鐵肌紅蛋白的氧化現(xiàn)象，結(jié)果表明相比于IOS系統(tǒng)，MOS系統(tǒng)能夠?qū)⒓≡w維蛋白激發(fā)到活性更高的自由基狀態(tài)。Promeyrat等[22]報(bào)道稱肉類體系中產(chǎn)生氧化羰基的能力與本身含有的肌紅蛋白數(shù)量密切相關(guān)，這暗示出肌紅蛋白對(duì)氧化的重要促進(jìn)作用。此外，Park等[23]還發(fā)現(xiàn)MOS系統(tǒng)在形成羰基化合物方面更敏感，而IOS系統(tǒng)則在蛋白熱力學(xué)特征改變方面更敏感。在該研究中設(shè)定固定羰基含量作為基準(zhǔn)，可以發(fā)現(xiàn)MOS的氧化敏感性明顯強(qiáng)于IOS。

在以前的研究中，Xiong等[9]發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白的氧化會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)交聯(lián)，引起蛋白構(gòu)象的變化，而該研究中同樣發(fā)現(xiàn)了牦牛肌原纖維蛋白功能特性的變化可能與二級(jí)結(jié)構(gòu)中-螺旋向-折疊的轉(zhuǎn)變有關(guān)。與此類似，Li等[24]發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白的氧化會(huì)引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)結(jié)構(gòu)的形成會(huì)導(dǎo)致濁度上升和硬度提高。研究認(rèn)為適當(dāng)?shù)难趸瘯?huì)令肉制品品質(zhì)產(chǎn)生改善作用，而過(guò)度的氧化則會(huì)令肉品質(zhì)劣變，正是基于這一理論才提出了氧化可以作為控制肉制品品質(zhì)的工具[6]。然而，很多研究都發(fā)現(xiàn)氧化對(duì)于肉品質(zhì)的不利影響，Li等[25]發(fā)現(xiàn)凍肉融化過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白氧化現(xiàn)象會(huì)破壞肌原纖維蛋白的水合特性；Chen等[26]發(fā)現(xiàn)10nmol/L的H2O2可以讓肌原纖維蛋白發(fā)生嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)交聯(lián)從而降低持水能力；Li等[27]發(fā)現(xiàn)氧化會(huì)破話凝膠類肉制品中肌原纖維蛋白的乳化能力，進(jìn)而影響凝膠的穩(wěn)定性；此外，Berardo等[28]解釋稱一般對(duì)肉制品品質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈劣變的氧化程度一般是羰基含量增加4 nmol/mg以上，這幾乎是該研究所涉及最大氧化程度的3倍以上。一般而言，公眾普遍認(rèn)為肌肉的氧化會(huì)引起品質(zhì)的劣變，但這個(gè)前提是氧化強(qiáng)度達(dá)到一定程度[29-31]，而該研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)难趸潭葘?duì)于牦牛肌原纖維蛋白的溶解性及乳化性有所改善，氧化系統(tǒng)在相同氧化水平下的改善作用存在一定差異。

4 結(jié) 論

肌原纖維蛋白的氧化是一種調(diào)控肉制品品質(zhì)的潛在工具，通過(guò)該研究可以發(fā)現(xiàn)MOS和IOS氧化體系會(huì)影響牦牛肌原纖維的生化特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及功能特性。在設(shè)定的氧化程度下，不同氧化體系表現(xiàn)出不同的影響規(guī)律，MOS體系在二硫鍵形成、表面疏水性變化、溶解度、乳化性以及乳化穩(wěn)定性方面對(duì)于氧化程度更加敏感，這2種氧化體系下功能特性改善的最佳氧化程度也存在差異。因此，有必要根據(jù)肌原纖維蛋白的氧化特性和結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)來(lái)實(shí)施相應(yīng)的氧化調(diào)控方案。

[1] Oswell N J, Thippareddi H, Pegg R B. Practical use of natural antioxidants in meat products in the U.S.: A review[J]. Meat Science, 2018, 145(3): 469-479.

[2] Domínguez R, Pateiro M, Gagaoua M, et al. A comprehensive review on lipid oxidation in meat and meat products[J]. Antioxidants (Basel). 2019, 8(10): 429.

[3] Estévez M. Protein carbonyls in meat systems: A review[J]. Meat Science, 2011, 89(3): 259-279.

[4] Li F, Wang B, Liu Q, et al. Changes in myofibrillar protein gel quality of porcine longissimus muscle induced by its stuctural modification under different thawing methods[J]. Meat Science, 2019, 147(1): 108-115.

[5] Chen L, Li C, Ullah N, et al. Different physicochemical, structural and digestibility characteristics of myofibrillar protein from PSE and normal pork before and after oxidation[J]. Meat Science, 2016, 121(2): 228-237.

[6] Lund M N, Heinonen M, Baron C P, et al. Protein oxidation in muscle foods: A review[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2011, 55(1): 83-95.

[7] Huang L, Ding B, Zhang H, et al. Textural and sensorial quality protection in frozen dumplings through the inhibition of lipid and protein oxidation with clove and rosemary extracts[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2019, 99(10): 4739-4747.

[8] Park D, Xiong Y L. Oxidative modification of amino acids in porcine myofibrillar protein isolates exposed to three oxidizing systems[J]. Food Chemistry, 2007, 103(2): 607-616.

[9] Xiong Y L, Park D, Ooizumi T. Variation in the crosslinking pattern of porcine myofibrillar protein exposed to three oxidative environments[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1): 153-159.

[10] Estévez M, Heinonen M. Effect of phenolic compounds on the formation of-aminoadipic and γ-glutamic semialdehydes from myofibrillar proteins oxidized by copper, iron and myoglobin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(7): 4448-4455.

[11] Liu G, Xiong Y L, Butterfield D A. Chemical, physical, and gel-forming properties of oxidized myofibrils and whey- and soy-protein isolates[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(5): 811-818.

[12] Thannhauser T W, Konishi Y, Scheraga H A. Analysis for disulfide bonds in peptides and proteins[J]. Methods in Enzymology, 1987, 143(1): 115-119.

[13] 李亮，柏韻，尚宏麗，等. 自由基氧化對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白的影響[J]. 食品工業(yè)科技， 2017， 38(24)：75-78. Li Liang, Bai Yun, Shang Hongli, et al. Effects of free radical oxidation on Chinese Penaeus myofibrillar protein[J]. Science and Technology of Food Industry, 2017, 38(24): 75-78. (in Chinese with English abstract).

[14] Chelh Ⅰ, Gatellier P, Santé-Lhoutellier Ⅴ. Technical note: A simplified procedure for myofibril hydrophobicity determination[J]. Meat Science, 2006, 74(4): 681-683.

[15] 李可，李燕，康超娣，等. 常壓等離子體射流對(duì)雞肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和流變特性的影響[J].食品科學(xué)：1-12[2020-02-06].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20191212. 1449.084.html. Li Ke, Li Yan, Kang Chaodi, et al. Effect of atmospheric pressure plasma jet on structural and rheological properties of chicken myofibrillar protein[J]. Food Science: 1-12[2020-02-06].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20191212. 1449.084.html. (in Chinese with English abstract).

[16] 李銀. 蛋白氧化對(duì)肌肉保水性的影響機(jī)制研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014. Li Yin. Effect-Mechanism of Protein Oxidation on Water-holding Capacity of Muscle[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2014. (in Chinese with English abstract).

[17] 崔文斌. 不同氧化體系對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白生化特性及質(zhì)構(gòu)的影響[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019. Cui Wenbin. Effects of Different Oxidation Systems on Biochemical Characteristics and Texture of Myofibrillar Protein during Beef Ripening[D]. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2019. (in Chinese with English abstract).

[18] 曹云剛，馬文慧，艾娜絲，等. 氧化強(qiáng)度對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及凝膠性能的影響[J]. 食品科學(xué)， 2019， 40(20)：21-27. Cao Yungang, Ma Wenhui, Ai Nasi, et al. Effects of different oxidation intensities on the structure and gel properties of myofibrillar protein[J]. Food Science, 2019, 40(20): 21-27. (in Chinese with English abstract).

[19] 崔文斌，王惠惠，劉小波，等. 羥自由基氧化對(duì)牦牛肉肌原纖維蛋白生化特性的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)， 2019， 33(6)：1165-1172. Cui Wenbin, Wang Huihui, Liu Xiaobo, et al. Effect of hydroxyl radical oxidation on the biochemical characteristics of myofibrillar protein of yak meat[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2019, 33(6): 1165-1172. (in Chinese with English abstract).

[20] Jiang J, Xiong Y L. Natural antioxidants as food and feed additives to promote health benefits and quality of meat products: A review[J]. Meat Science, 2016, 120(1): 107-117.

[21] Park D, Xiong Y L, Alderton A L. Concentration effects of hydroxyl radical oxidizing systems on biochemical properties of porcine muscle myofibrillar protein[J]. Food Chemistry, 2006, 101(3): 1239-1246.

[22] Promeyrat A, Sayd T, Laville E, et al. Early post-mortem sarcoplasmic proteome of porcine muscle related to protein oxidation[J]. Food Chemistry, 2011, 127(3): 1097-1104.

[23] Park D, Xiong Y L, Alderton A L, et al. Biochemical changes in myofibrillar protein isolates exposed to three oxidizing systems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(12): 4445-4451.

[24] Li Y Q, Kong B H, Xia X F, et al. Structural changes of the myofibrillar proteins in common carp () muscle exposed to a hydroxyl radical-generating system[J]. Process Biochemistry, 2013, 48(5): 863-870.

[25] Li F F, Wang B, Liu Q, et al. Changes in myofibrillar protein gel quality of porcine longissimus muscle induced by its stuctural modification under different thawing methods[J]. Meat Science, 2019, 147(1): 108-115.

[26] Chen L, Li C, Ullah N, et al. Different physicochemical, structural and digestibility characteristics of myofibrillar protein from PSE and normal pork before and after oxidation[J]. Meat Science, 2016, 121(1): 228-237.

[27] Li X, Liu C, Wang J, et al. Effect of hydroxyl radicals on biochemical and functional characteristics of myofibrillar protein from large yellow croaker ()[J]. Journal of Food Biochemistry, 2020, 44(1): e13084.

[28] Berardo A, Claeys E, Vossen E, et al. Protein oxidation affects proteolysis in a meat model system[J]. Meat Science, 2015, 106(1): 78-84.

[29] Gan X, Li H, Wang Z, et al. Does protein oxidation affect proteolysis in low sodium Chinese traditional bacon processing[J]. Meat Science, 2019, 150(1): 14-22.

[30] Huang M, Wang J, Zhuang H, et al. Effect of in-package high voltage dielectric barrier discharge on microbiological, color and oxidation properties of pork in modified atmosphere packaging during storage[J]. Meat Science, 2019, 149(1): 107-113.

[31] Wang Z, He Z, Gan X, Li H. Interrelationship among ferrous myoglobin, lipid and protein oxidations in rabbit meat during refrigerated and superchilled storage[J]. Meat Science, 2018, 146(1): 131-139.

Effects of MOS and IOS on the biochemical and functional traits of myofibrillar proteins of yak

Zhang Li1, Wang Huihui1, Song Yanyan1, Wei Jinmei2, Yu Qunli1, Han Ling1

(1.,,730070,; 2.,,730070,)

Oxidation is a potential tool to control meat quality, and the improvement of meat protein oxidation regulation theory is helpful to its application in food engineering. The protein oxidation systems in muscle are Ion Oxidizing System (IOS) and Metmyoglobin Oxidizing System (MOS). According to previous study, different oxidizing systems will lead to different oxidation phenomenon. So Elucidating the effects of different oxidation systems on biochemical and functional traits of myofibrillar proteins is helpful to improve the engineering theory and application of oxidation regulation of meat quality, which is more important for yak meat quality control because of its higher iron ion and metmyoglobin content. In order to investigate relationship between functional traits and chemical modification of myofibrillar proteins of yak under different oxidizing systems, the biochemistry traits (sulfhydryl content, disulfide bonds content, bityrosine content and surface hydrophobicity), secondary structure (-helix percent,-sheet percent,-turn percent and random coil percent) and functional traits (solubility, turbidity, emulsifying activity index, emulsifying stability index, foamability and foam stability) of myofibrillar proteins of yak were analyzed under IOS and MOS with similar oxidation degree (protein carbonyl content), meanwhile the correlation coefficient between functional traits and biochemical traits of myofibrillar proteins of yak were also analyzed. It was found that there were significantly decreasing thiol group, increasing disulfide bond, increasing bityrosine and decreasing surface hydrophobicity (<0.05) with increasing carbonyl concentration. Under IOS surface hydrophobicity insignificantly decrease when carbonyl concentration reached (1.19±0.06) nmol/mg. While the change of disulfide bond and surface hydrophobicity of MOS is more obviously than IOS when carbonyl concentration reached (1.51±0.13) nmol/mg which indicate that MOS is more sensitive to form disulfide bond. According to general liner model analysis, the interaction between oxidizing system and oxidizing degree on disulfide bonds content and surface hydrophobicity is significant which declare that the effects of oxidizing intensity on these chemical traits will be different because of different oxidizing system. When the carbonyl content increases by 1.22 nmol/mg to reach a high level, the-helix structure will decrease by about 17%, while the proportion of the-sheet structure significantly increases by about 13.5% (<0.05). With the increase of the degree of oxidation, the protein solubility first increased and then decreased. The peak of the solubility appeared at the medium level (carbonyl content (1.51±0.13) nmol/mg). When the oxidation level reached the medium level, the solubility of the MOS system was significantly higher than that of the IOS system, indicating that the solubility change of the MOS system was more sensitive to the oxidation intensity. Moderate oxidation can improve the solubility and emulsification of myofibrillar proteins of yak and the optimal range of improvement depend on oxidizing system. The effect of MOS on functional traits is more sensitive to oxidation degree. Through correlation analysis, it can be found that disulfide bond is significantly correlated with solubility, turbidity, emulsification and other functional characteristics, while the most indexes secondary structure is significantly correlated with solubility and turbidity. It is shown that different oxidation systems have different effects on the biochemical and functional properties of myofibrillar, and MOS system can improve the functional properties at a lower degree of oxidation, which is related to the more significant changes in disulfide bonds and surface hydrophobicity

meat; oxidation; biochemistry; yak; myofibrillar proteins; functional traits

張麗，王惠惠，宋艷艷，等. IOS和MOS對(duì)牦牛肌原纖維蛋白生化與功能特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(9)：308-314.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.09.035 http://www.tcsae.org

Zhang Li, Wang Huihui, Song Yanyan, et al. Effects of MOS and IOS on the biochemical and functional traits of myofibrillar proteins of yak[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(9): 308-314. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.09.035 http://www.tcsae.org

2020-02-11

2020-03-11

國(guó)家自然基金（31660469）；中國(guó)國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛牦牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目（CARS-38）

張麗，教授，博士，主要從事于畜產(chǎn)品加工和安全研究。Email：zlwlzyc@163.com.

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.09.035

TS251.1

A

1002-6819(2020)-09-0308-07