橡皮生肌膏對大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的影響及機制研究

凌水蓮 張昊悅 王業(yè)皇

摘要 目的：探討橡皮生肌膏對大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的影響及可能的機制。方法：采用綜合法構(gòu)建肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型，將30只模型大鼠隨機分為模型組（n=15）與實驗組（n=15）;另選15只僅造成創(chuàng)口，不敷糞液作為對照組。實驗組予橡皮生肌膏外敷;對照組與模型組予無菌生理鹽水紗布外敷，均2次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。采用激光多普勒血流儀測定創(chuàng)面動態(tài)血流值;采用HE染色與Wb法檢測創(chuàng)面組織病理學(xué)特點與VEGF、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，實驗組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（P<0.05）;在干預(yù)第3、7、14天，模型組與實驗組大鼠創(chuàng)面動態(tài)血流值逐漸升高，但模型組低于對照組，實驗組高于模型組（P<0.05）;與對照組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織VEGF蛋白相對表達(dá)量顯著降低，實驗組高于模型組;TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量升高，實驗組低于模型組（P<0.05）。結(jié)論：橡皮生肌膏可促進大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)面局部血運，其作用機制可能與抑制創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6表達(dá)，促進VEGF表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 肛瘺;橡皮生肌膏;愈合率;VEGF;TNF-α;IL-6

Abstract Objective：To explore the effects of Xiangpi ShengJi Ointment on wound healing after anal fistula operation in rats and its possible mechanisms.Methods：The rat models of anal fistula wounds after operation were established by a comprehensive method，and 30 rats models were randomly divided into a model group（n=15）and a test group（n=15）; Another 15 were selected to cause wounds only，and no fecal fluid was used as a control group.The test group were treated with Xiangpi ShengJi Ointment externally; the control group and model group were treated with sterile saline gauze，all 2 times/d，and were intervened continuously for 14 d.Laser doppler flowmeter was used to measure the dynamic blood flow value of the wound; HE staining and Wb method were used to detect the histopathological characteristics and VEGF，TNF-α，IL-6 protein expression.Results：Compared with the model group，the wound healing rate in the test group significantly increased（P<0.05）; on the 3rd，7th and 14th day of intervention，the dynamic blood flow value of the wounds gradually increased in rats in the model group and the test group，but the model group was lower than the control group，and the test group was higher than the model group（P<0.05）; compared with the control group，the relative expression of VEGF protein in the wound tissues significantly reduced in the model group，and that in the test group was higher than that in the model group; the relative expression levels of TNF-α and IL-6 proteins increased.Those in the test group were lower than those of the model group（P<0.05）.Conclusion：Xiangpi ShengJi Ointment can promote wound healing in rats with anal fistula after operation and improve local blood flow，and its mechanisms may be related to inhibiting the expression of TNF-α and IL-6 and promoting the expression of VEGF in the wound tissues.

Keywords Anal fistula; Xiangpi ShengJi Ointment; Healing rate; VEGF; TNF-α; IL-6

肛瘺是肛腸科臨床常見疾病，是由原發(fā)性內(nèi)口、瘺管和繼發(fā)性外口3部分組成，其發(fā)病率較高且不能自愈，必須采取手術(shù)治療，但由于手術(shù)部位的特殊性，術(shù)后流膿、水腫、瘙癢、出血、疼痛等是其常見并發(fā)癥，嚴(yán)重時還可出現(xiàn)消瘦、發(fā)熱等癥狀[1-2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肛瘺的發(fā)病以感受風(fēng)濕燥熱之邪或肛癰潰后余毒未清，不能托毒外出，久不收口所致，而肛瘺術(shù)后愈合緩慢的創(chuàng)面，屬于中醫(yī)潰瘍的范疇，其主要病因為經(jīng)絡(luò)受邪，入臟腑，為內(nèi)所因也;四肢九竅，血脈相傳，壅塞不通，為外皮膚所中也;房事、金刃、蟲獸所傷，究其病因，肛瘺術(shù)后的創(chuàng)面屬金刃所傷，臨床上以清熱解毒、消腫止痛、斂瘡生肌為治療大法[3]。橡皮生肌膏是中醫(yī)外科具有生肌長皮作用的常用藥物，具有防腐收斂、驅(qū)痹填髓長肉、生肌斂瘡、活血止痛、清熱瀉火解毒、抗炎、抗感染之功效[4]。為進一步研究橡皮生肌膏對肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的作用及可能的作用機制，因此本研究構(gòu)建肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型，旨在為改善肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級、雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，購于揚州大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)合格證號為SCXK（蘇）2017-0007。飼養(yǎng)條件、環(huán)境：飼養(yǎng)于揚州大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗室，每籠5只，溫度（25±2）℃，濕度（55±2）%，光照明暗時間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。

1.1.2 藥物 橡皮生肌膏（天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：0923）。

1.1.3 試劑與儀器 蘇木精-伊紅（HE）染色液（北京維德維康生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：180823）;兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體（英國Abcam公司，生產(chǎn)批號：H181120）;兔抗鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）抗體（美國Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號分別為：M181122、M181011）等。

PeriFlux 5000型激光多普勒血流儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號：SKK-1100）;PowerLab Chart5 v5.2.2圖像分析軟件（美國ADInstruments公司，型號：ADKS-3100）;KD-202型石蠟切片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號：KDS-1711）;5810R型高速低溫離心機（德國Eppenndorf Centrifuge公司，型號：ESD-1733）;DM LB2型光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司，型號：LKS-1610）;M200 PRO型多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司，型號：TEF-1510）;QuantityOne 1-D分析軟件（美國Bio-Rad公司，型號：BID-1611）等。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型建立[5]、分組 采用綜合法構(gòu)建肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型，術(shù)前備皮，氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，采用創(chuàng)傷制作器在脊柱旁側(cè)0.5 cm處切割直徑約為1.8 cm的圓形創(chuàng)口，且肌層傷口厚度約為0.3 cm，止血后在創(chuàng)面上加糞液1 mL，固定（油紗、敷料、膠帶），48 h后去除覆蓋物，若見傷口有膿性分泌物與糞臭味出現(xiàn)，表示造模成功。將成功建立的30只肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠隨機分為模型組（n=15）及實驗組（n=15）;另選擇15只僅造成創(chuàng)口后不敷以糞液作為對照組。

1.2.2 干預(yù)方法 實驗組大鼠傷口給予等面積的橡皮生肌膏完全覆蓋創(chuàng)面，其上再蓋無菌紗布并固定;對照組與模型組給予無菌生理鹽水紗布外敷并固定;3組均每天換藥2次，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.3 創(chuàng)面愈合率測定 末次干預(yù)結(jié)束后，觀察、測定各組大鼠的創(chuàng)面愈合情況[6]。創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.4 激光多普勒血流儀測定創(chuàng)面動態(tài)血流值 于干預(yù)第3、7、14天，采用激光多普勒血流儀測定創(chuàng)面動態(tài)血流值，將MSP2OOXP表面探頭放置在肛瘺內(nèi)口創(chuàng)面上，每個創(chuàng)面選3個點（以肛瘺內(nèi)口的頂端為第1個點，在瘺道走行方向上取第2和第3個點），每點記錄30 s，采用PowerLab Chart5 v5.2.2圖像分析軟件進行分析，取其3點測量值的平均值作為該內(nèi)口創(chuàng)面的血流值[7]。

1.2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色[8]觀察創(chuàng)面組織病理學(xué)特點 干預(yù)第14天的創(chuàng)面動態(tài)血流值測定后，頸椎脫臼法處死大鼠，采集創(chuàng)面組織，10%甲醛固定液固定45 min后，經(jīng)脫水、包埋、切片等制作石蠟切片，進行常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織病理學(xué)特點。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Wb）法[9]檢測創(chuàng)面組織VEGF、TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá)水平 取液氮中保存的創(chuàng)面組織，冷研磨后加入細(xì)胞裂解液，12 000 r/min離心10 min，測定蛋白量。取待測樣品（20 μg）進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗，常溫下孵育2 h。采用QuantityOne 1-D分析軟件分析各條帶的灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，符合正態(tài)分布時，2組之間比較采用Dunnett′s t檢驗;不符合正態(tài)分布時，采用秩和檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的創(chuàng)面愈合率比較 模型組與實驗組大鼠創(chuàng)面愈合率分別為（12.37±2.64）%、（78.64±5.12）%;與模型組比較，實驗組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（P<0.05）。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面動態(tài)血流值比較 在干預(yù)第3、7、14天，模型組與實驗組大鼠創(chuàng)面動態(tài)血流值逐漸升高，但與對照組比較，模型組大鼠創(chuàng)面動態(tài)血流值降低，且實驗組高于模型組（P<0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)特點 模型組大鼠可見創(chuàng)面以瘢痕修復(fù)為主，有少量肉芽組織形成，且伴有大量炎性細(xì)胞浸潤;實驗組大鼠可見創(chuàng)面有較多肉芽組織增生、成熟，同時可見血管增生，表皮增生角化，且炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，修復(fù)良好;而對照組大鼠相應(yīng)位置的組織結(jié)構(gòu)完整，無異常變化。見圖1。

2.4 各組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá)水平 與對照組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織VEGF蛋白相對表達(dá)量顯著降低，且實驗組高于模型組;模型組大鼠創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量升高，且實驗組低于模型組（P<0.05）。見表2，圖2。

3 討論

肛瘺是一種反復(fù)發(fā)作的肛腸疾病，由于其發(fā)病部位的特殊性，術(shù)后創(chuàng)面不易保持清潔、干燥，所以切口一般不予縫合，故術(shù)后創(chuàng)面愈合緩慢、傷口疼痛，病程長;術(shù)后創(chuàng)面愈合情況是手術(shù)成敗的主要決定因素，同時炎性反應(yīng)與創(chuàng)口血運是影響創(chuàng)面愈合的重要原因[10]。在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，肛瘺稱為“肛漏”，病機多為肛癰潰后余毒未盡，結(jié)滯不散;或臟腑素虛，復(fù)感邪毒，氣血壅結(jié)，肉腐成膿，因此，當(dāng)以清熱燥濕、補氣化瘀為治療原則;對創(chuàng)面進行局部的換藥目的旨在祛腐生肌、拔膿消腫，運用中藥方消除肛瘺術(shù)后及潰瘍創(chuàng)面水腫、滲液，改善創(chuàng)面局部血運，促進創(chuàng)面新組織增生，使新生的肉芽組織逐漸填充創(chuàng)腔，以達(dá)到促進創(chuàng)面愈合的目的[11]。橡皮生肌膏組方出自于張山雷《瘍科綱要》，藥物組成主要包括橡皮、當(dāng)歸、地黃、血余炭、爐甘石、石膏等，其中橡皮具有止血、斂瘡的功效;當(dāng)歸補血活血、消腫止痛、排膿生肌;地黃具有清熱、生津滋陰、涼血之功效;血余炭有消瘀、止血之功;爐甘石有解毒、收濕止癢斂瘡之功;石膏清熱解毒、瀉火，諸藥合用具有防腐收斂、生肌斂瘡、清熱解毒、活血止痛之功效[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，象皮生肌膏可提高壓瘡缺血再灌注損傷大鼠新生肉芽組織中纖維結(jié)合蛋白含量，促進壓瘡傷口愈合。本研究結(jié)果顯示，實驗組大鼠創(chuàng)面愈合率與創(chuàng)面動態(tài)血流值均顯著高于模型組，且創(chuàng)面肉芽組織形成情況優(yōu)于模型組，提示橡皮生肌膏可促進大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)面局部血運，從而緩解病情。

創(chuàng)面修復(fù)是多因子參與的復(fù)雜調(diào)控過程，而炎性反應(yīng)與創(chuàng)口局部血供情況是影響肛瘺創(chuàng)面愈合、修復(fù)的重要因素[14]。炎性反應(yīng)是機體創(chuàng)傷后的基本防御性反應(yīng)，TNF-α、IL-6是常見炎性因子，可促進機體炎性反應(yīng)，參與肛瘺術(shù)后多種并發(fā)癥的發(fā)生與進展[15]。研究顯示，參黃洗液熏洗可促進痔術(shù)后創(chuàng)面愈合，其機制可能與下調(diào)大鼠血清中IL-8及TNF-α水平有關(guān)[16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，橡皮生肌膏中的地黃與爐甘石可抗炎、止癢;血余炭抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛;石膏也具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[17]。曹暉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，象皮生肌膏可明顯提高大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合率，縮短創(chuàng)面愈合時間，其作用機制可能與降低創(chuàng)面組織中炎性反應(yīng)因子表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，實驗組大鼠創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量均低于模型組，提示橡皮生肌膏可抑制大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面組織中炎性因子表達(dá)，緩解炎性癥狀。血管生成對創(chuàng)面組織愈合至關(guān)重要，VEGF是重要的血管生長因子，可促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖，有利于毛細(xì)血管形成，改善創(chuàng)面微循環(huán)，從而促進創(chuàng)面愈合[19]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，橡皮生肌膏組方中的當(dāng)歸具有促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖進而促進血管再生的作用[20]，但目前尚無關(guān)于橡皮生肌膏對VEGF作用的相關(guān)報道，本研究結(jié)果顯示，實驗組大鼠創(chuàng)面組織VEGF蛋白相對表達(dá)量顯著高于模型組，提示橡皮生肌膏可促進大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面組織中VEGF蛋白表達(dá)，促進血管生成，改善創(chuàng)面微循環(huán)，最終促進創(chuàng)面愈合。

綜上所述，橡皮生肌膏可促進大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)面局部血運，同時抑制大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面組織中炎性因子表達(dá)，促進VEGF蛋白表達(dá)，最終促進創(chuàng)面愈合，這為臨床肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的治療提供了新思路，也為橡皮生肌膏的推廣使用提供了理論依據(jù)。

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