益腎調(diào)氣法對血管性癡呆模型大鼠腦單胺神經(jīng)遞質(zhì)的干預(yù)作用

王丹 趙瑞珍 李小黎

摘要 目的：通過探討血管性癡呆（VD）大鼠腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)變化，研究益腎調(diào)氣法對VD大鼠的干預(yù)機制。方法：選購雄性Wistar大鼠，通過曠場試驗分為正常組、卒中組。MCAO法制備缺血性腦卒中模型，常規(guī)飼養(yǎng)28 d后經(jīng)水迷宮試驗篩選VD大鼠，并隨機分為觀察組和模型組。正常組和模型組灌胃蒸餾水，觀察組灌胃頤腦解郁方，干預(yù)4周。灌胃第1、2、4周對各組大鼠行水迷宮檢測;第4周灌胃后取材，采用高效液相檢測大鼠右側(cè)海馬、前額葉皮質(zhì)5-HT、NE、DA含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠1、2、4周跳臺潛伏期縮短、錯誤次數(shù)增加、水迷宮潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，觀察組第2、4周水迷宮潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），第4周跳臺潛伏期延長、錯誤次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。模型組皮質(zhì)及海馬NE、DA、5-HT含量較正常組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），觀察組海馬DA含量較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：益腎調(diào)氣法可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機制可能與調(diào)節(jié)大鼠腦內(nèi)NE、DA及5-HT含量相關(guān)。

關(guān)鍵詞 血管性癡呆;頤腦解郁方;去甲腎上腺素;多巴胺;5-羥色胺;益腎調(diào)氣法;動物實驗

Abstract Objective：To study the intervention mechanism of tonifying kidney and regulating qi method on vascular dementia（VD）rats by investigating the changes of monoamine neurotransmitters in the brain of VD rats.Methods：Male Wistar rats were selected and divided into a normal group and a stroke group by open field test.MCAO method was used to prepare ischemic stroke model.After 28 d of routine feeding，VD rats were screened by water maze test and randomly divided into a treatment group and a model group.The normal group and the model group were infused with distilled water，and the treatment group was infused with Yinao Jieyu Formula for 4 weeks.At the 1st，2nd and 4th weeks of gavage，the rats in each group were tested for water maze，and at the 4th week after gavage，the material was taken and the contents of 5-HT，NE，DA in the right hippocampus and prefrontal cortex of rats was detected by high-performance liquid.Results：Compared with the normal group，the latent period of 1，2 and 4 weeks of platform jumping were shortened，the number of errors increased，and the latent period of water maze was significantly prolonged（P<0.01）.Compared with the model group，the latent period of water maze at 2 and 4 weeks of treatment group was shortened（P<0.01），and the latent period of platform jumping at 4 weeks was prolonged and the number of errors decreased（P<0.01）.The content of NE，DA，5-HT in the cortex and hippocampus of the model group was lower than that in the normal group（P<0.01），and the hippocampal DA content in the treatment group was higher than that in the model group（P<0.01）.Conclusion：The tonifying kidney and regulating qi treatment can improve the learning and memory ability of VD rats，and its mechanism may be related to the content of NE，DA and 5-HT in the rat brain.

Keywords Vascular dementia; Yinao Jieyu Formula; Norepinephrine; Dopamine; 5-hydroxytryptamine;Tonifying kidney and regulating qi method; Animal experiments

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是腦卒中后常見并發(fā)癥之一，該病發(fā)生率高，臨床表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知功能障礙，屬于嚴(yán)重認(rèn)知障礙的腦血管疾病[1]。中醫(yī)歸屬“多忘”“癡呆”“呆病”等范疇，目前對于卒中后向VD轉(zhuǎn)變的機制尚未有明確結(jié)論。近年來，國內(nèi)外學(xué)者從神經(jīng)遞質(zhì)對VD的發(fā)病機制進行了深入探討，其含量的變化與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切[2-3]，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上通過觀察血管性癡呆大鼠模型中藥干預(yù)前后的行為學(xué)及前額葉皮質(zhì)、海馬不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度3個方面的變化情況，探討頤腦解郁方對腦缺血后VD大鼠的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠（200±10）g，SPF級，6周齡，動物許可證：SCXK（京）2016-0006，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。大鼠適應(yīng)性預(yù)養(yǎng)1周，自由攝食和飲水，動物房室溫（23±1）℃（冷、熱應(yīng)激除外），相對濕度50%～60%，光照周期晝夜各12 h（6：00～18：00光照;18：00～6：00黑暗）。

1.1.2 藥物 頤腦解郁方顆粒（由郁金、刺五加等藥物組成，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院制成顆粒）。配比成419 mg/kg混懸液（即1劑配方顆粒加100 mL蒸餾水）相當(dāng)于成人劑量的7倍計算，存貯在4 ℃的冰箱中備用，再臨用前加熱。

1.1.3 試劑與儀器 尼龍栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司，貨號：2838-A4）、戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，貨號P3761-5），去甲腎上腺素試劑（美國Sigma公司，貨號：A9512）、多巴胺試劑（美國Sigma公司，貨號：H8502）、5-羥色胺試劑（美國Sigma公司，貨號：H7752）。電子天平（珠恒電子有限公司監(jiān)制，型號：JCS-11002A）、Morris水迷宮（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，型號：KW-MWM）大鼠跳臺儀（中國中醫(yī)科學(xué)院，型號：DZY-DG-8S）、高效液相色譜儀（美國ESA公司，型號：Model 5600A）、8通道庫侖電化學(xué)檢測器（美國ESA公司，型號：Model 5300A），美國EAS公司軟件（美國ESA公司，型號：Version3.1）、超速低溫離心機（美國Sigma公司，型號：2K15）、超聲波發(fā)生器（美國Sigma公司，型號：MJ-300）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備

1.2.1.1 分組 購入雄性Wistar大鼠65只，飼養(yǎng)1周，采用Open-filed評分隨機分為正常組10只、腦卒中模型組55只。用MCAO法制備缺血性腦卒中模型，MCAO術(shù)中死亡9只，術(shù)后1周死亡7只，28 d后經(jīng)Morris水迷宮篩選出20只VD大鼠進入實驗，隨機分為模型組、觀察組，正常組10只，模型組10只，觀察組10只。

1.2.1.2 模型制備 1）缺血性腦卒中（Ischemic Stroke，IS）大鼠模型制備：制備IS模型[4]，大鼠稱重后，用1%戊巴比妥鈉溶液5 mL/kg腹腔注射麻醉。沿頸正中線開口約1.5 cm，鈍性分離兩側(cè)肌肉及腺體，暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，在頸總動脈近心端開一小口，插入尼龍栓線至頸內(nèi)動脈，當(dāng)栓線插入距頸總動脈分叉1.8～2.0 cm處并有輕微阻力時即可。造模成功后的大鼠待2 h后將栓線輕輕抽出0.5～1.0 cm，使血液再灌注。2）參考Longa 5分制法，其中0分表示無神經(jīng)損傷癥狀;1分表示不能完全伸展對側(cè)前爪;2分表現(xiàn)為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分表現(xiàn)為向?qū)?cè)傾倒;4分表現(xiàn)為不能自發(fā)行走，意識喪失，分值越高，說明大鼠行為障礙越嚴(yán)重。對術(shù)后2 h再灌注后大鼠，待其麻醉清醒后進行評分，將評分小于等于1分及大于等于4分大鼠剔除，不予納入。大鼠于缺血再灌注2 h后出現(xiàn)行走轉(zhuǎn)圈、對側(cè)前肢蜷曲或走向?qū)?cè)傾倒的體征者可納入，無此體征或者2 h后仍不清醒者，棄去。3）制備建立MCAO模型后，對大鼠進行常規(guī)飼養(yǎng)，于28 d后行水迷宮評價[5-6]，（實驗組大鼠平均逃避潛伏期-正常組組大鼠平均逃避潛伏期）/實驗組大鼠平均逃避潛伏期>20%定為VD鼠進入實驗。

1.2.2 給藥方法 VD模型組灌胃蒸餾水，觀察組灌胃中藥頤腦解郁方，灌胃劑量10 mL/kg，1次/d，持續(xù)4周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 宏觀表征像觀察 于每周灌胃前1 d觀察各組大鼠的表征像，包括觀察各組大鼠的行為活動（如活動度、攻擊行為、探索行為、修飾行為等）、精神狀態(tài)、以及毛發(fā)色澤、糞便質(zhì)地以及舌質(zhì)舌色等一般情況的變化。

1.2.3.2 行為學(xué)測試 1）Morris水迷宮實驗[7]（Water Maze Test，WMT）在安靜、恒溫的暗室進行，室溫（23±1）℃、水溫（22±1）℃。水迷宮的直徑1.8 m，水深情況31 cm，水迷宮分為4個象限，平臺放置于任1象限內(nèi)1/3處，平臺低于水面1 cm，位置保持不變。實驗分5 d進行，前4 d訓(xùn)練1次/d，第5天測試。前4 d為定位航行實驗，為：每只大鼠實驗4次/d，每次從4個象限隨機選取1個，并將大鼠放置水中，每只動物1個象限只能使用1次;單次游泳時限60 s;記錄大鼠尋找、爬到平臺所用時間，為逃避潛伏期。再讓動物在平臺上停留30 s后，進行下次的方向訓(xùn)練;如果60 s內(nèi)沒有找到水面下隱藏在的站臺，則實驗者再將大鼠引至平臺地方;平臺上個再停留30 s后，進行下一方向訓(xùn)練。當(dāng)實驗進行到第5天，撤平臺后進行空間探索試驗（Spatial probe），于定位航行實驗后24 h后，撤除站臺，從對側(cè)象限放入大鼠，使其游泳60 s，記錄逃避潛伏期及穿越平臺位置次數(shù)。2）跳臺實驗跳臺裝置為15 cm×30 cm×30 cm的被動條件反應(yīng)箱，將直徑和高度都為4.5 cm大小的橡皮墊置于箱內(nèi)底部一角作為被動回避電擊反應(yīng)的安全區(qū)。實驗時先將大鼠放入箱中訓(xùn)練3 min，接通36 V交流電，記大鼠5 min內(nèi)被電擊的錯誤次數(shù)，為大鼠學(xué)習(xí)測試的成績。24 h后進行記憶測試，測試時直接將大鼠放置于安全平臺上，立即通電并記錄每只大鼠第1次錯誤次數(shù)和跳下安全區(qū)的時間潛伏期），作為記憶測試成績。入組大鼠在造模結(jié)束后分別于1、2、4周進行行為學(xué)測試，包括跳臺實驗、Morris水迷宮測試。

1.2.3.3 大鼠右側(cè)前皮質(zhì)及海馬NE、DA、5-HT含量測定 完成行為學(xué)測試后，將大鼠斷頭而處死，在冰上迅速剝離出右側(cè)前額葉皮質(zhì)、海馬，微量秤稱重，將組織質(zhì)量控制在20～50 mg，加入0.4 mL預(yù)冷的工作內(nèi)標(biāo)液，于冰浴下快速勻漿，靜置10 min，4 ℃條件下14 000 g離心15 min，取上清液，用0.20 μm濾膜過濾，取100 μL上樣測定或-80 ℃保存檢測NE、DA、5-HT的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示;不符合正態(tài)分布，用四分位數(shù)描述。符合正態(tài)分布且方差齊時，在多組間采用單因素方差分析比較，同組間比較則選取LSD檢驗;方差不齊時采用Weltch檢驗。數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)分析;重復(fù)測量數(shù)據(jù)，符合球形檢驗，采用重復(fù)測量方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組宏觀表征像觀察 VD組大鼠造模結(jié)束后，在灌胃1、2、4周節(jié)點觀察發(fā)現(xiàn)，VD模型大鼠無明顯變化，大部分靜默少動，進食飲水較多、梳理行為較少，糞便稀溏。與之比較，灌胃4周后VD觀察組自發(fā)活動、梳理行為增多、體質(zhì)量稍減輕，糞便成形。

2.2 各組VD大鼠行為學(xué)變化

2.2.1 各組VD大鼠不同時間點跳臺實驗結(jié)果比較 灌胃1、2、4周后與正常組比較，VD模型組及VD觀察組潛伏期均顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;于灌胃4周時與VD模型組比較，VD觀察組潛伏期時間顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;灌胃1、2、4周時與正常組比較，VD模型組錯誤次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;治療后VD觀察組與VD模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2.2 各組VD組大鼠不同時間點Morris水迷宮實驗結(jié)果比較 灌胃1周后與正常組比較，模型組大鼠逃避潛伏期的時間延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與VD模型組比較，VD觀察組逃避潛伏期時間沒有延長，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;灌胃2周后與正常組比較，模型組逃避潛伏期時間明顯延長，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與模型組比較，觀察組逃避潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;灌胃4周后與正常組比較，模型組的逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，觀察組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

2.2.3 各組右側(cè)前額葉皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化比較 與正常組比較，VD模型組NE、DA、5-HT含量均顯著性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與VD模型組比較，VD觀察組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.2.4 各組右側(cè)海馬NE、DA、5-HT含量變化比較? 與正常組比較，VD模型組NE、DA、5-HT含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，VD觀察組DA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。VD觀察組的NE、5-HT呈升高趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

血管性癡呆（VD）是腦血管病變導(dǎo)致顱腦局灶性神經(jīng)功能損害引起的以認(rèn)知功能障礙為特征的一組臨床綜合征[8]。歸于中醫(yī)學(xué)的“癡呆”“呆病”“多忘”等范疇。中醫(yī)上，腦卒中后，腎精虧虛，不足以充盛腦髓，髓海虧虛元神失養(yǎng)[9]，則反應(yīng)遲鈍、出現(xiàn)神情淡漠、思維緩慢、記憶力減退等癥狀;肝腎同源，因腎精不足可致肝血虧虛;肝失疏泄，氣機不暢，故可見情緒低落、胸悶不舒等癥狀，隨著病程遷延，因虛致實，痰瘀互結(jié)，腎虛基礎(chǔ)上，上蒙清竅，使病情更加纏綿難愈。導(dǎo)師通過總結(jié)多年來的臨床經(jīng)驗，提出血管性癡呆在發(fā)生發(fā)展過程中，腎虛是其發(fā)病的基礎(chǔ)，氣機失調(diào)則為發(fā)病之誘因[10]為卒中后精神疾患的基本病機。治療以益腎調(diào)氣法譴方而成之頤腦解郁方是導(dǎo)師唐啟盛教授臨床多年經(jīng)驗的總結(jié)，臨床取得了較好的療效，但其作用靶點尚不清楚。

本次研究中就VD組大鼠而言，與正常組比較，VD模型大鼠整體表現(xiàn)為精神疲憊、喜倦臥懶動、眼神無光，對外界刺激反應(yīng)低下，便質(zhì)稀溏，口鼻色稍暗，舌潤澤，舌色淡紅，在1、2、4周節(jié)點上，VD模型組大鼠跳臺實驗潛伏期時間較正常組均明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增加，而水迷宮逃避潛伏期時間明顯延長，較好地模擬了血管性癡呆患者認(rèn)知功能及學(xué)習(xí)、記憶能力下降等核心臨床表現(xiàn)，經(jīng)中藥頤腦解郁方治療4周后，觀察組大鼠跳臺潛伏期時間延長，2、4周時水迷宮逃避潛伏期時間縮短，提示中藥頤腦解郁方可以有效改善大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。腦血管病變后隨著病程的延長，癡呆大鼠的逃避潛伏期時間（空間學(xué)習(xí)）及穿越平臺次數(shù)（記憶能力）也逐漸下降。與臨床血管性癡呆患者不同階段出現(xiàn)的反應(yīng)遲鈍、思維混亂、記憶模糊、智力障礙等癥狀表現(xiàn)類似。因此結(jié)合多次行為學(xué)研究可以更好地探索出卒中后精神疾患模型大鼠的精神狀況，而不同時間點行為學(xué)結(jié)果均均證實中藥頤腦解郁方能在血管性癡呆不同階段對大鼠表征像、行為學(xué)進行有效調(diào)節(jié)，這為我們進一步探討頤腦解郁方對這一疾患發(fā)生發(fā)展過程中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的干預(yù)作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

神經(jīng)遞質(zhì)作為連接腦內(nèi)神經(jīng)元化學(xué)突觸之間的信使，主要充當(dāng)信息傳遞功能。其作用機制為通過與其突觸后受體結(jié)合而產(chǎn)生神經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)。本研究主要的單胺神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT有廣泛的活性，其神經(jīng)纖維上行，可投射至額葉、海馬，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，共同協(xié)調(diào)的前額葉皮質(zhì)是Papez環(huán)路的起始部位，海馬是Papez環(huán)路的重要組成部分，與學(xué)習(xí)、記憶方面等功能相關(guān)[11-13]，額葉被認(rèn)為在認(rèn)知功能、行為和決策能力起重要作用。本次研究的IS大鼠模型均為右側(cè)腦組織缺血壞死，右側(cè)海馬明顯灌注不足，與左側(cè)比較，引起更為顯著的變化[14]，故取大鼠右側(cè)海馬、前額葉皮質(zhì)作為觀察標(biāo)本。

NE神經(jīng)元參與中樞系統(tǒng)的記憶學(xué)習(xí)，經(jīng)調(diào)節(jié)突觸而出現(xiàn)減少干擾刺激的傳入，能更好地記錄及保存有效信息[15];DA在調(diào)節(jié)額葉記憶功能方面起著主要作用[16];5-HT調(diào)節(jié)大腦的智能方面發(fā)揮著極其重要的作用[17]。本研究結(jié)果表明，NE、DA、5-HT均有不同程度地降低，提示當(dāng)大腦缺血缺氧時，腦組織中的遞質(zhì)含量減少，從而引起記憶功能的改變[18]。本次研究觀察組VD大鼠海馬區(qū)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)含量較模型組增加，提示大腦海馬區(qū)域神經(jīng)遞質(zhì)的減少與VD的發(fā)病可能相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，NE、DA、5-HT作為最主要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)不僅參與了大腦行為的調(diào)控，還與情感障礙、學(xué)習(xí)和認(rèn)知障礙相關(guān)。頤腦解郁方可以改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)及記憶力下降，其作用機制可能改善大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA的含量有關(guān)。由此可見，本研究初步驗證了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)能是頤腦解郁方發(fā)揮作用的一個靶點，但具體機制仍需進一步的探討和研究。

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