• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用芥菜轉(zhuǎn)錄組信息挖掘SSR標(biāo)記及用于種質(zhì)分析

    2020-06-19 07:47:36李永平張雙照薛珠政溫慶放
    福建農(nóng)業(yè)學(xué)報 2020年2期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄組芥菜多態(tài)性

    李永平 張雙照 薛珠政 溫慶放

    摘要:[目的]為開發(fā)高效的芥菜Brassicajuncea.分子標(biāo)記。[方法]本研究通過對芥菜轉(zhuǎn)錄組測序的信息搜索SSR位點并分析其分布特點,應(yīng)用Primer 3.0軟件設(shè)計SSR引物,隨機選擇50對引物擴(kuò)增44份芥菜種質(zhì),檢測其多態(tài)性。[結(jié)果]芥菜轉(zhuǎn)錄組測序共獲得55636條tmigene,全部序列有48193376bp;有7834條unigene包含SSR的序列,從中鑒定出9526個SSR位點,其中有1371條序列包含1個以上SSR,復(fù)合SSR有572個,SSR發(fā)生頻率為14.08%。優(yōu)勢重復(fù)基序為三核苷酸和二核苷酸,分別占總SSR的51.12%和41.91%。二核苷酸重復(fù)基元中以AG/CT為優(yōu)勢重復(fù)基元,占總位點的34.74%,三核苷酸重復(fù)基元以AAG/CTT為主,占總位點的18.30%。共設(shè)計出21282對SSR引物,隨機選擇50對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中41對擴(kuò)增出清晰可重復(fù)的預(yù)期條帶,17對(占34%)在44份芥菜種質(zhì)中表現(xiàn)出多態(tài)性。應(yīng)用UPGMA得到將44份供試材料分為4大類聚類圖,可準(zhǔn)確地體現(xiàn)了芥菜種質(zhì)材料的關(guān)系。[結(jié)論]根據(jù)芥菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能開發(fā)出類型豐富、效率較高的SSR標(biāo)記,為芥菜親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建等提供更可靠的標(biāo)記。

    關(guān)鍵詞:芥菜;轉(zhuǎn)錄組;SSR;多態(tài)性

    中圖分類號:S649文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1008-0384(2020)02-0169-09

    (研究意義)芥菜(Brassicajuncea)十字花科蕓薹屬植物,原產(chǎn)中國,并在中國發(fā)生豐富的變異和分化,全國有1000多份不同的芥菜品種。收集的種質(zhì)資源混雜多樣,因此對芥菜的種質(zhì)資源的親緣關(guān)系鑒定及分類意義重大,有利于提高芥菜種質(zhì)的利用效率。(前人研究進(jìn)展)目前對芥菜的起源進(jìn)化、分類和遺傳多樣性已有研究。依據(jù)葉形態(tài)特征,如基生葉的裂刻、刺毛的有無、葉形的變化、莖與根的變異等,Vauzb8n等將芥菜劃分了4個類群。孟秋峰等對17個芥菜變種植物學(xué)性狀進(jìn)行聚類,結(jié)果分為葉用芥菜、莖用芥菜、根用芥菜、薹用芥菜和籽用芥菜等5個類。(本研究切入點)微衛(wèi)星序列(Simple sequence repeat,SSR)分子標(biāo)記,在生物基因組中普遍存在,是一種可信賴的、使用方便分子標(biāo)記之一,常用于作物遺傳信息分析、品種鑒別、建立遺傳圖譜等。EST-SSR標(biāo)記較基于基因組序列開發(fā)的SSR標(biāo)記種間通用性更高,更經(jīng)濟(jì)方便。EST-SSR標(biāo)記在辣椒、菜薹、菠菜、大白菜、甘藍(lán)和洋蔥等一些主要蔬菜作物中都有開發(fā)與應(yīng)用,芥菜的EST-SSR標(biāo)記開發(fā)利用未見報道。(擬解決的關(guān)鍵問題)本研究中應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR標(biāo)記搜索,設(shè)計EST-SSR引物,評價引物的多態(tài)性效率,為芥菜種質(zhì)遺傳信息鑒定、遺傳信息利用等開發(fā)可靠、高效的分子標(biāo)記。

    1 材料與方法

    1.1轉(zhuǎn)錄組測序

    測序材料“龍芥2號”于9月15日播種,lo月5日定植于福建省龍巖市新羅區(qū)龍門鎮(zhèn)赤水村,11月5日,選取3株健康無病植株,每株選幼葉葉稍處取5g樣品,液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆?。廣州基迪奧生物科技有限公司采用Illumina HiSeq TM 2500PEl25系統(tǒng),設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(無參),經(jīng)過濾得到4.82G的有效RNA-seq數(shù)據(jù)。

    1.2材料及其DNA提取

    項目組收集的44份芥菜種質(zhì)材料(表1)用于SSR引物篩選和有效性評價。供試材料基因組DNA用CTAB法提取。

    1.3 SSR位點搜索及SSR引物設(shè)計

    用MISA程序(http://pgrc.ikp-gatersleben.de/misa)對轉(zhuǎn)錄組的所有Unigene進(jìn)行搜索,尋找Unigene中的SSR,搜索參數(shù)為二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)分別大等于6、5、5、4和4次且2個SSR序列的距離不短于100bp;用Primer 3.0軟件對每條SSR設(shè)計3對引物并評價。引物要求為:序列長度18~25bp,GC含量40%~60%,上、下游引物的Tm值≤2℃,預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物100~400bp,不產(chǎn)生二聚體。

    1.4 SSR引物篩選

    20uLPCR反應(yīng)體系:lommol·L-1dNTPs0.4uL,5U Taq酶0.3uL,100ng DNA 1.0uL,10umol·L-1的上、下游引物各0.8uL,10× Buffer(Mg2+)2.0uL,ddH2O 14.7ul.PCR熱程序如下:94℃5m;94℃30s,58℃30s,72℃ 30s,30個循環(huán);72℃5min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    SSR發(fā)生頻率=SSR的unigene數(shù)量/總unigene數(shù);SSR出現(xiàn)頻率=SSR個數(shù)/總unigene數(shù),SSR平均分布距離=unigene堿基數(shù)/SSR數(shù)?!?”:“0”法統(tǒng)計電泳數(shù)據(jù),應(yīng)用NTsys2.10e聚類分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1SSR的分布特征

    芥菜轉(zhuǎn)錄組測序獲得55636條unigene(總長約48193376bp),經(jīng)MISA軟件搜索發(fā)現(xiàn)9526個SSR位點發(fā)布于7834條unigene上。SSR發(fā)生頻率14.08%,出現(xiàn)頻率、17.12%,平均5.06kb有1個SSr.包含有二至六核苷酸重復(fù)類型,其中三核苷酸和二核苷酸重復(fù)是主要形式,分別占總SSR的51.12%與41.91%;其他3種苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少共占總數(shù)的6.97%(表2)。

    芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)最低4次,最高位42次,共有9241個SSR重復(fù)次數(shù)為4~10次,占總數(shù)的97.01%;285個SSR重復(fù)次數(shù)在11~42次,占總數(shù)的2.99%。芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR的長度為12~324bp,主要集中于12~18bp,此長度間SSR達(dá)8230個,占總數(shù)的86.40%,長度大于18bp的SSR有1296個,只占13.60%。

    2.2 轉(zhuǎn)錄組中SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

    芥菜轉(zhuǎn)錄組的重復(fù)基序較為豐富,共有172種重復(fù)基序,分布見表3.AG/CT重復(fù)基序發(fā)生頻率最高為34.74%,占二核苷酸重復(fù)的總數(shù)的82.89%;其次是AAG/CTT重復(fù)基序,發(fā)生頻率為18.30%,占三核苷酸總數(shù)的35.79%。四核苷酸有25種重復(fù)基序、五核苷酸41重復(fù)基序、六核苷酸重復(fù)基序達(dá)92種,分布較散,發(fā)生的頻率不高。

    2.3 芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計與篩選

    遵照引物設(shè)計的標(biāo)準(zhǔn),7834條含SSR位點的unigene序列,共設(shè)計得引物21282對。從不同核苷酸重復(fù)單元的引物中隨機挑選50對,PCR擴(kuò)增龍芥2號DNa.結(jié)果為50對引物均能擴(kuò)增,其中4l對(82.00%)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為100~400bp,9對(18%)擴(kuò)增產(chǎn)物長度超400bp.

    2.4多態(tài)性分析

    用上述擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小相符的41對引物擴(kuò)增44份芥菜種質(zhì)資源(圖1),有17對(41.46%)引物具有特異性(表4)。17對多態(tài)性引物擴(kuò)增46個多態(tài)性片段,平均每對引物擴(kuò)增2.71個多態(tài)性片段。PIC值的大小代表多態(tài)性息的豐富程度,17對引物的PIC最高值達(dá)到0.82,平均值為0.60,僅BaSSR007、BaSSR043引物PIC值較低為0.43和0.47,表明這些17對芥菜SSR標(biāo)記含有豐富的多態(tài)信息。17對多態(tài)性引物中二核苷、三核苷酸、五核苷重復(fù)的各4、6、3對,四核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)的各2對。

    對多態(tài)性SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果聚類分析,在遺傳距離0.82處,44份芥菜種質(zhì)材料被分成四大類(圖2)。

    第Ⅰ大類包括36個莖用、葉用芥菜材料;第Ⅱ大類包括5個結(jié)球芥材料:17、35、22、4l、43;第Ⅲ大類包括2個紫葉芥材料:2、42;第Ⅳ大類:薹芥品種38單獨成類。第Ⅰ大類36個材料在遺傳距離0.67處聚為4個亞類:(1)此亞類包含1、4、9、15、44、30、36、40、39、37、11等11個莖用材料和21、16、7、24、19、23、29、20、18等9個葉用材料;(2)含葉面有刺毛4個材料25、26、27、28;(3)此亞類包含5個株型半直立的材料32、31、12、33、34;(4)此亞類包含7個葉面平滑材料3、14、5、13、8、6、10.

    3 討論

    高通量測序快速發(fā)展,EST數(shù)量得到迅速增加,為EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用提供了條件,許多植物的EST-SSR標(biāo)記已被開發(fā)應(yīng)用。芥菜EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)利用國內(nèi)未見報道。本研究從芥菜的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的55636條unigene搜索獲得7834條unigene序列共9526個SSR位點,SSR發(fā)生頻率為14.08%,出現(xiàn)頻率為17.12%。此結(jié)果較菠菜、洋蔥、黨參等4.33%~16,10%的頻率范圍略高,但低于菜薹19.26%和蘿卜23.79%和的SSR位點頻率。SSR發(fā)生頻率與物種基因組差異、轉(zhuǎn)錄組測序的時期選擇、獲得數(shù)據(jù)量大小與質(zhì)量、SSR搜索工具的選擇及篩選的參數(shù)設(shè)置等因素密切相關(guān)。芥菜SSR含二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)5種類型,以三核苷酸和二核苷酸重復(fù)為主要形式,分別占總SSR的51.12%與41.91%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少,分別占總數(shù)的3.70%、1.40%和1.87%,與菜薹、芝麻、蘿卜等作物的研究結(jié)果有所不同,這與SSR搜索參數(shù)設(shè)置有關(guān)。二、四和五核苷酸重復(fù)多在非翻譯區(qū)(UTR),三、六核苷酸重復(fù)與編碼序列(CDS)密切相關(guān),芥菜三核苷酸重復(fù)SSR占絕對優(yōu)勢,說明芥菜轉(zhuǎn)錄組unigene中的CDS信息更豐富。AAG/CTT和AG/CT重復(fù)基序在眾多基序占優(yōu)勢,與在大白菜、黃秋葵的結(jié)果一致。選取的50對SSR引物擴(kuò)增‘龍芥2號DNA,9對(18%)引物擴(kuò)增產(chǎn)物超預(yù)期,擴(kuò)增不成功的因素可能是引物內(nèi)含子在啟動位點引起SNPS/InDel變異,或是組裝錯誤。多態(tài)性引物占有效引物的41.46%,低于洋蔥(45.00%),高于辣椒(36.84%)、菠菜(17.43.00%),說明所設(shè)計的芥菜SSR標(biāo)記引物多態(tài)性較好。有研究認(rèn)為,SSR標(biāo)記的多態(tài)性可能與重復(fù)序列長度呈正相關(guān),重復(fù)序列長于20bp的SSR,表現(xiàn)多態(tài)性的概率高;重復(fù)序列長度小于20bp的SSR呈多態(tài)性的可能性明顯較低。本研究中17對多態(tài)性引物僅有2對來自于長度小于20bp重復(fù)序列。PIC值可用于衡量標(biāo)記的多態(tài)信息,本研究中17對多態(tài)引物的平均PIC值為0.60,最低值0.43發(fā)生在重復(fù)序列最短序列的引物BaSSR007上,15對引物PIC值均大于0.5,結(jié)果說明本研究開發(fā)的芥菜EST-SSR有較高的多態(tài)性。

    李寧等用SRAP標(biāo)記將111份芥菜歸為薹芥、葉用芥和莖用芥、紫葉芥和長柄芥5類,遺傳相似系數(shù)為0.38~0.89,表明芥菜在分子水平上遺傳多樣性較豐富。本研究應(yīng)用EST-SSR標(biāo)記分類44份芥菜種質(zhì)材料的結(jié)果與其相似,但與運用AFLP、RAPD、ISSRL等標(biāo)記研究的結(jié)果不盡相同,這可能與不同分子標(biāo)記所揭示的基因組片段的變異方式不同有關(guān)。

    RAPD、ISSR、SRAP等標(biāo)記技術(shù)均開發(fā)于無基因組(或轉(zhuǎn)錄組)序列信息,隨機性強、穩(wěn)定性差。EST-SSR來自基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)并與功能基因緊密連鎖,具有豐富多態(tài)性,較高靈敏度,可重復(fù)性強等優(yōu)勢。本研究利用基于芥菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得17對SSR引物,對44份芥菜種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析,以遺傳距離0.82為閾值,44份芥菜種質(zhì)材料分為四大類,SRAP標(biāo)記等無法將結(jié)球和不結(jié)球芥菜完全分開,而SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確分開,較ISSR、SRAP等標(biāo)記的分析結(jié)果,SSR標(biāo)記更準(zhǔn)確地體現(xiàn)了芥菜種質(zhì)材料的關(guān)系。

    猜你喜歡
    轉(zhuǎn)錄組芥菜多態(tài)性
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進(jìn)展
    不同芥菜品種(系)對鎘脅迫的響應(yīng)
    基于轉(zhuǎn)錄組測序的山茱萸次生代謝生物合成相關(guān)基因的挖掘
    金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR位點信息分析
    人參屬藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展
    馬鈴薯cpDNA/mtDNA多態(tài)性的多重PCR檢測
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    大豆轉(zhuǎn)錄組測序研究進(jìn)展綜述
    種子在黑暗中能發(fā)芽嗎
    CYP3A4*1G基因多態(tài)性及功能的初步探討
    亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲国产高清在线一区二区三| 最近最新中文字幕大全免费视频| 中文字幕高清在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 国产高清videossex| av欧美777| 国产激情久久老熟女| 欧美在线黄色| 首页视频小说图片口味搜索| 成人av一区二区三区在线看| 国模一区二区三区四区视频 | 麻豆成人午夜福利视频| 两个人的视频大全免费| 在线观看日韩欧美| 亚洲全国av大片| 久久这里只有精品19| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 色综合站精品国产| 精品高清国产在线一区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久精品成人免费网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 村上凉子中文字幕在线| 国产乱人伦免费视频| 黄色丝袜av网址大全| 国模一区二区三区四区视频 | 欧美乱色亚洲激情| 免费搜索国产男女视频| 小说图片视频综合网站| 最近在线观看免费完整版| 成人国产一区最新在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产又黄又爽又无遮挡在线| 黄色片一级片一级黄色片| 床上黄色一级片| 美女免费视频网站| 一区二区三区激情视频| 特级一级黄色大片| 男人的好看免费观看在线视频 | 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品久久久久久久电影 | 国产熟女xx| 欧美黑人巨大hd| 身体一侧抽搐| 久久久国产成人精品二区| 国产av一区二区精品久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美不卡视频在线免费观看 | 特级一级黄色大片| www.www免费av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一夜夜www| 欧美三级亚洲精品| 99久久精品国产亚洲精品| 99re在线观看精品视频| 久久久久久久久免费视频了| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av成人一区二区三| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产视频内射| 国产精品一及| 亚洲av成人一区二区三| 精品久久久久久久末码| 午夜视频精品福利| 成人三级做爰电影| 99热只有精品国产| 亚洲国产欧美网| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 美女大奶头视频| 国产精品一区二区免费欧美| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲一区中文字幕在线| 久久久国产成人免费| 啦啦啦免费观看视频1| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 天天添夜夜摸| 精品不卡国产一区二区三区| 99热6这里只有精品| 国产av一区二区精品久久| 一级毛片高清免费大全| 亚洲精华国产精华精| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品 欧美亚洲| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品福利观看| x7x7x7水蜜桃| 免费电影在线观看免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 免费看十八禁软件| 日韩成人在线观看一区二区三区| 九色国产91popny在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 午夜免费激情av| 日韩欧美精品v在线| 脱女人内裤的视频| 男女视频在线观看网站免费 | 色精品久久人妻99蜜桃| 国产男靠女视频免费网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久中文字幕人妻熟女| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久久国产成人精品二区| 国产av不卡久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲男人天堂网一区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| av福利片在线| 久久午夜亚洲精品久久| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲人成电影免费在线| a在线观看视频网站| 成人午夜高清在线视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲黑人精品在线| 日韩高清综合在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 免费在线观看成人毛片| 国产午夜精品久久久久久| 妹子高潮喷水视频| 午夜久久久久精精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久人人精品亚洲av| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 国产午夜精品久久久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲国产精品sss在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 少妇粗大呻吟视频| 999精品在线视频| 国产野战对白在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 成年免费大片在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 此物有八面人人有两片| 精品高清国产在线一区| 亚洲人与动物交配视频| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲熟女毛片儿| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 1024视频免费在线观看| 久久亚洲精品不卡| 午夜激情av网站| 国产精品久久电影中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产在线观看jvid| 日本熟妇午夜| 成熟少妇高潮喷水视频| 大型av网站在线播放| 国产一区在线观看成人免费| 日本熟妇午夜| 校园春色视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 人人妻人人澡欧美一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜激情福利司机影院| 亚洲无线在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产亚洲精品av在线| 国产区一区二久久| 黄频高清免费视频| 国产一区二区在线观看日韩 | 免费无遮挡裸体视频| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩高清综合在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美日韩黄片免| 国产激情欧美一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久人人精品亚洲av| 日韩国内少妇激情av| 久久伊人香网站| 亚洲五月婷婷丁香| АⅤ资源中文在线天堂| 男人舔女人的私密视频| 日韩欧美在线乱码| 狂野欧美激情性xxxx| 国产成人精品久久二区二区91| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久草成人影院| 最近最新免费中文字幕在线| 精品乱码久久久久久99久播| 日韩免费av在线播放| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 日本 av在线| 亚洲电影在线观看av| 男男h啪啪无遮挡| 国产v大片淫在线免费观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 在线免费观看的www视频| 亚洲全国av大片| 天天一区二区日本电影三级| 正在播放国产对白刺激| 亚洲人成电影免费在线| 一个人免费在线观看电影 | 色哟哟哟哟哟哟| 国产日本99.免费观看| av在线天堂中文字幕| 在线观看一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 日韩三级视频一区二区三区| 午夜影院日韩av| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人av激情在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品 国内视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜老司机福利片| 后天国语完整版免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 精品久久蜜臀av无| 国产人伦9x9x在线观看| 一级毛片精品| 成人18禁在线播放| aaaaa片日本免费| 桃红色精品国产亚洲av| 香蕉丝袜av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费看a级黄色片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线播放国产精品三级| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 香蕉av资源在线| 欧美日韩乱码在线| 1024视频免费在线观看| 女警被强在线播放| 欧美极品一区二区三区四区| 国产成人av激情在线播放| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美性长视频在线观看| 久久 成人 亚洲| 国产av一区在线观看免费| 又爽又黄无遮挡网站| 1024手机看黄色片| 大型av网站在线播放| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久国产精品影院| 国产亚洲精品av在线| 两个人看的免费小视频| 91麻豆av在线| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产野战对白在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 成人国语在线视频| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜福利视频1000在线观看| 日韩av在线大香蕉| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品九九99| 亚洲精品色激情综合| 亚洲国产欧美一区二区综合| 少妇的丰满在线观看| 精品福利观看| 激情在线观看视频在线高清| 中文资源天堂在线| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 天堂影院成人在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 性欧美人与动物交配| 午夜老司机福利片| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久久久国内视频| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲av熟女| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 1024香蕉在线观看| 国产高清激情床上av| 成人三级黄色视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 91字幕亚洲| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 少妇粗大呻吟视频| 不卡一级毛片| 一区二区三区激情视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品一区二区精品视频观看| 一本久久中文字幕| 1024视频免费在线观看| 免费搜索国产男女视频| 日韩av在线大香蕉| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人午夜高清在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 大型av网站在线播放| 69av精品久久久久久| 国产成人精品无人区| 69av精品久久久久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 夜夜爽天天搞| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久精品成人免费网站| 又大又爽又粗| 成年人黄色毛片网站| 后天国语完整版免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久九九热精品免费| 国产av又大| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美激情久久久久久爽电影| 白带黄色成豆腐渣| 免费无遮挡裸体视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 黄色成人免费大全| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 妹子高潮喷水视频| 国产爱豆传媒在线观看 | 亚洲精华国产精华精| a在线观看视频网站| 欧美成狂野欧美在线观看| 成人av在线播放网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 桃色一区二区三区在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 中文在线观看免费www的网站 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 午夜福利欧美成人| 俺也久久电影网| 中文字幕高清在线视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲18禁久久av| 亚洲成av人片免费观看| 观看免费一级毛片| 国产精品亚洲一级av第二区| 99热只有精品国产| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 嫁个100分男人电影在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 特大巨黑吊av在线直播| 级片在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩欧美国产一区二区入口| 99re在线观看精品视频| 久久久久久久久久黄片| 亚洲性夜色夜夜综合| 色播亚洲综合网| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩欧美在线乱码| 亚洲片人在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| a级毛片a级免费在线| 在线看三级毛片| 在线国产一区二区在线| 亚洲精品在线美女| 国产在线观看jvid| 国产欧美日韩精品亚洲av| 51午夜福利影视在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美日韩黄片免| av国产免费在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产高清有码在线观看视频 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 黑人欧美特级aaaaaa片| 无限看片的www在线观看| 欧美三级亚洲精品| 国产在线观看jvid| 麻豆国产97在线/欧美 | 成人av在线播放网站| 成人亚洲精品av一区二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 男人舔女人的私密视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| a在线观看视频网站| 国产单亲对白刺激| 大型黄色视频在线免费观看| 国产av一区二区精品久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 十八禁人妻一区二区| 国产成人欧美在线观看| 国产激情欧美一区二区| 白带黄色成豆腐渣| 此物有八面人人有两片| 久久天堂一区二区三区四区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 午夜免费激情av| 国产亚洲欧美98| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲精品在线美女| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | av视频在线观看入口| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲专区字幕在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 宅男免费午夜| 69av精品久久久久久| 最新在线观看一区二区三区| 日日夜夜操网爽| 熟女电影av网| 99riav亚洲国产免费| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产亚洲av高清不卡| 国语自产精品视频在线第100页| 国产三级在线视频| 变态另类丝袜制服| 日本一二三区视频观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 超碰成人久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲av成人av| 日韩大码丰满熟妇| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一本综合久久免费| 亚洲精品在线观看二区| 九色成人免费人妻av| 亚洲成av人片免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久99久视频精品免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产av一区二区精品久久| 欧美在线一区亚洲| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲成av人片在线播放无| 此物有八面人人有两片| 色综合站精品国产| 女警被强在线播放| 成人一区二区视频在线观看| 不卡一级毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| www.www免费av| 正在播放国产对白刺激| 欧美成人午夜精品| 18禁美女被吸乳视频| 香蕉久久夜色| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产片内射在线| 美女午夜性视频免费| 国产视频内射| 在线观看免费视频日本深夜| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产免费av片在线观看野外av| 一进一出抽搐动态| 手机成人av网站| 国产三级黄色录像| 欧美中文综合在线视频| 亚洲 国产 在线| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久久久国产a免费观看| 1024视频免费在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久久久久久免费视频了| 999精品在线视频| 国产一区二区激情短视频| 99久久国产精品久久久| 91九色精品人成在线观看| 亚洲国产精品999在线| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久中文看片网| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产探花在线观看一区二区| 日韩精品青青久久久久久| 免费看美女性在线毛片视频| 国产97色在线日韩免费| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 最好的美女福利视频网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产一区二区在线观看日韩 | 一进一出好大好爽视频| 18禁美女被吸乳视频| www.精华液| 两个人的视频大全免费| 色综合站精品国产| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费高清视频大片| 首页视频小说图片口味搜索| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久香蕉国产精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 妹子高潮喷水视频| 午夜亚洲福利在线播放| 久久人妻av系列| 国产一区在线观看成人免费| 国产成人aa在线观看| 香蕉久久夜色| av欧美777| 好男人在线观看高清免费视频| 无限看片的www在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 男女午夜视频在线观看| 俺也久久电影网| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费看日本二区| 老汉色∧v一级毛片| 成人午夜高清在线视频| 久久热在线av| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美性猛交黑人性爽| 天堂影院成人在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 午夜激情福利司机影院| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品av久久久久免费| 国内精品久久久久精免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久香蕉激情| 亚洲熟女毛片儿| 日日干狠狠操夜夜爽| 中文资源天堂在线| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美极品一区二区三区四区| 老汉色∧v一级毛片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成人三级做爰电影| 妹子高潮喷水视频| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品免费视频内射| 老鸭窝网址在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 一个人免费在线观看电影 | 操出白浆在线播放| 熟女电影av网| 俄罗斯特黄特色一大片| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品九九99| 中文在线观看免费www的网站 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产亚洲精品av在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产av又大| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 啪啪无遮挡十八禁网站| 91九色精品人成在线观看| 美女黄网站色视频| 国产精品 欧美亚洲| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 99久久精品国产亚洲精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久精品影院6| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲第一电影网av| 他把我摸到了高潮在线观看| 日韩欧美在线二视频| 丰满的人妻完整版| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲美女视频黄频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| avwww免费| 国产高清videossex| 在线永久观看黄色视频| www.熟女人妻精品国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久草成人影院| 精华霜和精华液先用哪个| 校园春色视频在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久伊人香网站| 精品国产美女av久久久久小说|