培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對油木奈種胚培育效應(yīng)

陳潔 劉瑾航 李永裕 吳少華 廖汝玉

摘要：[目的]篩選適宜不同狀態(tài)油櫬種胚的胚培育條件，提高種胚萌發(fā)率。[方法]以福建特色果樹油櫬為試驗材料，分析油櫬種胚狀態(tài)、培養(yǎng)基種類以及植物生長調(diào)節(jié)劑對油櫬種胚萌發(fā)的影響，篩選出合適的培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑組合進行胚培育，提高種胚的萌發(fā)率。[結(jié)果]在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的條件下，接種于WPM培養(yǎng)基的半敗育種胚最高的萌發(fā)率為40.00%;在添加植物生長調(diào)節(jié)劑的條件下，接種于WPM培養(yǎng)基添加2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA（6號）的半敗育種胚都有著最高的萌發(fā)率，為46.67%。完整種胚的最高萌發(fā)率為100.00%，分別為不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基或添加1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA（2號）、2.0mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA（3號）、2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA（6號）的WPM培養(yǎng)基。

[結(jié)論]最適宜油櫬種胚萌發(fā)的是WPM培養(yǎng)基+2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA，且完整胚的萌發(fā)率都要高于半敗育的萌發(fā)率。不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基也都具有較好的萌發(fā)效果。

關(guān)鍵詞：油櫬，種胚，植物生長調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基，離體培養(yǎng)

中圖分類號：S662.3文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）03-0303-06

0 引言

（研究意義）油木奈是福建特色名果，在福建古田、浦城等地大量種植。油櫬除鮮食外，還可制棕干、罐頭、蜜餞等，發(fā)展前景廣闊。核果類果樹的早熟品種常因果實發(fā)育期短，胚發(fā)育不成熟，很難獲得成熟的種胚。不成熟種胚不利于通過常規(guī)層積播種成苗，是核果類早熟新品種選育的主要障礙因子。油櫬種胚在果實發(fā)育過程中敗育現(xiàn)象明顯，影響油木奈產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。胚培育技術(shù)是克服油櫬種胚敗育的關(guān)鍵技術(shù)，通過培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑處理挽救即將敗育或已經(jīng)發(fā)生敗育的種胚，提高品種的萌芽率和成苗率。胚培育不受季節(jié)等限制，能在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的具有優(yōu)良遺傳性狀的苗木，滿足市場的各種需求，也可進一步為組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化提供原始材料。此外，胚培育可以克服雜交育種中雜種胚發(fā)育不良的問題，縮短育種年限，為關(guān)于油木奈的科學(xué)研究快速發(fā)展提供幫助。（前人研究進展）前人研究發(fā)現(xiàn)桃屬、李屬等核果類果樹使用較多的為SH、MS、1/2MS和White培養(yǎng)基。在無植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM和MS培養(yǎng)基上，油櫬成熟胚能萌發(fā)形成一定數(shù)量的小苗。剝?nèi)シN皮的成熟胚萌芽率高于帶種皮的成熟胚，光照有利于成熟胚的萌發(fā)和發(fā)育。核果類果實胚培需要經(jīng)歷一段時間的低溫。朱學(xué)文等研究發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基中附加5、8、10mg·L^-1的6-BA均能有效打破種子的休眠，不需低溫貯藏。此外，胚挽救應(yīng)該選擇在胚發(fā)育程度較高，即將開始敗育的時期，有利于提高胚培成功翠，桃和杏胚培養(yǎng)成功的例證較多。（本研究切入點）目前，油木奈主要通過種胚培養(yǎng)誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，并建立繼代保持體系來進行油櫬種胚的離體培養(yǎng)，但較少研究油櫬種胚萌發(fā)直接成苗的種胚離體培養(yǎng)，以及不同培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑組合對油木奈種胚萌發(fā)的影響。油木奈種胚在發(fā)育過程中，中途敗育是普遍現(xiàn)象，而對油木奈種胚培育技術(shù)缺乏相關(guān)研究。在近年的雜交育種實踐中，克服種胚敗育的影響已成為棕李育種成敗的關(guān)鍵。（擬解決的關(guān)鍵問題）本研究以油木奈種胚為試驗材料，篩選不同狀態(tài)油櫬種胚合適的培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑組合，提高種胚的萌發(fā)率。以期建立胚培育技術(shù)體系，為雜交育種服務(wù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗材料 油木奈果實取自福建省寧德市古田縣湖濱鎮(zhèn)常壩村。

1.1.2儀器與試劑 WPM（Lloyd&McCown WoodyPlant Basal Medium with Vitamin）培養(yǎng)基（為PhytoTechnology公司的產(chǎn)品）、MS（Murashig and SkoogMedium）培養(yǎng)基、SH（Schenk&HildebrandtMedium）培養(yǎng)基。氯化汞、吐溫60、乙醇、蔗糖均為分析純。6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，瓊脂粉為北京康倍斯（chembase）科技有限公司產(chǎn)品。

恒溫培養(yǎng)室（鐵架臺和控溫控光控濕設(shè)施）、超凈工作臺、接種器械滅菌器、鑷子、解剖刀、高壓滅菌鍋、人工氣候箱、日本島津電子分析天平、梅特勒-托利多pH計、電磁爐、培養(yǎng)瓶、玻璃棒、接種盤等。

1.2 試驗方法

1.2.1 采樣與種胚處理 采樣日期為2018年6月6日，采樣地點位于福建省寧德市古田縣湖濱鎮(zhèn)常壩村試驗基地。在基地內(nèi)選取3個試驗小區(qū)，每個小區(qū)選定3顆樹齡相同、樹勢基本一致的試驗樹作為試驗樣品采集的對象。在每株油木奈果樹的東南西北4個方向，高度基本一致的樹冠外圍各摘取一定數(shù)量、大小均勻一致的油櫬。采樣在氣候良好的上午采摘，采摘后立即送往實驗室進行清洗，用枝剪剪開果肉，剪破果核取出種胚。記錄下種胚（胚乳）發(fā)育狀態(tài)，以胚乳大小界定種胚的敗育情況：胚乳大小>3/4正常胚乳為完整種胚;胚乳大小1/2至3/4正常胚乳，為半敗育種胚;胚乳<1/2正常胚乳為敗育胚。

1.2.2培養(yǎng)基的配制滅菌 分別配制MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、SH培養(yǎng)基等3種不同類型的培養(yǎng)基，3種培養(yǎng)基添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑，分別為6-BA（0.0、1.0、2.0mg·L^-1）、IBA（0.0、0.1、0.2mg·L^-1）、NAA（0.0、0.1、0.2mg·L^-1），正交試驗設(shè)計，每種培養(yǎng)基共有9組植物生長調(diào)節(jié)劑組合（表1）。每種培養(yǎng)基分別加入的蔗糖皆為30g·L^-1，加入瓊脂量分別為10g·L^-1、9g·L^-1、7g·L^-1，pH皆調(diào)為6.0.

培養(yǎng)基加入蔗糖配制后，調(diào)節(jié)溶液pH至6.0，再將溶液倒人鍋內(nèi)，加人稱量好的瓊脂粉，進行加熱煮沸至瓊脂完全溶解后，關(guān)閉加熱的電磁爐，將溶液分裝入培養(yǎng)瓶中，并用標(biāo)簽紙在瓶蓋上做好標(biāo)記，記錄配制日期，配制瓶數(shù)等信息。將分裝好的培養(yǎng)瓶、無菌水、濾紙、用棉布包好的接種盤等放人高壓滅菌鍋內(nèi)在121℃下高壓滅菌20min.高壓過后取出培養(yǎng)基等物品置于常溫下，2～3d后觀察培養(yǎng)基的污染情況并及時剔除受污染的培養(yǎng)基。植物生長調(diào)節(jié)劑組合編號為1-9.

1.2.3 油捺種胚消毒方法 將油木奈種胚、無菌水、接種盤、濾紙、廢液瓶、鑷子、解剖刀、配制好的培養(yǎng)基等物品放人超凈工作臺紫外消毒殺菌20min，將超凈工作臺紫外燈消毒過的種胚經(jīng)無菌水沖洗1-2次，加入75%酒精消毒30s，無菌水沖洗2～3次，加入0.1%的升汞水和2～3滴吐溫60消毒8min，消毒過程中不停搖晃裝有種胚的玻璃瓶，使消毒藥劑與種胚充分接觸，減少污染的發(fā)生，繼續(xù)用無菌水沖洗3～4次種胚。

1.2.4接種及低溫培養(yǎng) 將消毒好的完整種胚和半敗育種胚分別接種人培養(yǎng)瓶中，完整種胚接種5瓶，半敗育種胚接種7瓶，每瓶培養(yǎng)基接種2粒種胚，共重復(fù)3次。接種后放人4-8℃的冷庫進行低溫培養(yǎng)，110d后統(tǒng)計萌發(fā)率并轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)室后繼續(xù)進行培養(yǎng)。恒溫培養(yǎng)室溫度為25℃，光照強度1500～2000Lx，濕度70%～80%，光暗周期為12-12h.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)處理由Excel和SPSS 22.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種胚和培養(yǎng)基類型的胚培萌發(fā)率

油櫬種胚接種在培養(yǎng)基置于低溫培養(yǎng)110d后，調(diào)查油櫬種胚的萌發(fā)情況（表2）。半敗育胚的萌發(fā)率最高為17.11%（WPM培養(yǎng)基），最低為0.90%（SH培養(yǎng)基）;完整胚的萌發(fā)率最高為68.54%（MS培養(yǎng)基），最低為18.89%（SH培養(yǎng)基）。半敗育胚的最高萌發(fā)串低于完整胚的最低萌發(fā)率（17.11%<18.89%）。完整胚的萌發(fā)率都高于半敗育種胚的萌發(fā)率，這可能是由于飽滿完整的種胚中含有更多的營養(yǎng)物質(zhì)和合適比例的植物生長調(diào)節(jié)劑促進了種胚的萌發(fā)，完整種胚比半敗育種胚有更大的萌發(fā)潛力。最適合半敗育胚萌發(fā)的培養(yǎng)基是WPM培養(yǎng)基，最適合完整胚萌發(fā)的是MS培養(yǎng)基。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑處理下SH培養(yǎng)基中油木奈種胚的萌發(fā)情況

9組植物生長調(diào)節(jié)劑組合條件下，種胚的萌發(fā)率各有差異，見表3.1號組合為對照（CK），不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑。3號（2.0mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA）植物生長調(diào)節(jié)劑加入SH培養(yǎng)基后半敗育種胚的萌發(fā)率為3.33%，其他植物生長調(diào)節(jié)劑組合半敗育種胚的萌發(fā)率都為0.00%。SH培養(yǎng)基中完整種胚的萌發(fā)率由高到低分別為6號（61.90%）、8號（50.00%）、4號（30.95%）、5號（14.29%）、7號（9.52%）、9號和2號（7.14%），其它植物生長調(diào)節(jié)劑組合完整種胚的萌發(fā)率都為0.SH培養(yǎng)基半敗育種胚的萌發(fā)率比較低，添加植物生長調(diào)節(jié)劑完整種胚的萌發(fā)率最高也只有61.90%，這可能說明SH培養(yǎng)基并不適合油木奈半敗育種胚的萌發(fā)。

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑處理下WPM培養(yǎng)基中油木奈種胚的萌發(fā)情況

如表4，WPM培養(yǎng)基中6號植物生長調(diào)節(jié)劑組合（2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA）和未添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的對照組的半敗育胚的萌發(fā)率較高，半敗育胚萌發(fā)率分別為46.67%、40.00%。WPM培養(yǎng)基中完整胚萌發(fā)率為100%的植物生長調(diào)節(jié)劑組合分別為2號（1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA）、3號（2.0mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA）、6號（2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA）和未添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的對照組。除了這4組植物生長調(diào)節(jié)劑組合，WPM培養(yǎng)基中完整種胚萌發(fā)率較高的還有7號（76.19%）、8號（61.91%）、5號（50.00%）。綜合來看，WPM培養(yǎng)基中，適合油櫬種胚萌發(fā)的組合為添加2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA的6號植物生長調(diào)節(jié)劑組合、添加2.0mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA的3號和未添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑組合的對照組。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑處理下MS培養(yǎng)基中油櫬種胚的萌發(fā)情況

如表5，MS培養(yǎng)基中半敗育種胚的萌發(fā)率最高為6號（2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA）的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，萌發(fā)率為6.67%，3號和9號植物生長調(diào)節(jié)劑組合萌發(fā)率為3.33%，其他植物生長調(diào)節(jié)劑組合的半敗育胚的萌發(fā)率都為0.完整種胚的萌發(fā)率由高到低分別為1號（90.48%）=3號（90.48%）>9號（80.95%）>6號（71.43%）>7號（57.14%）=8號（57.14%）>5號（50.00%）>2號（0.00%）=3號（0.00%）。MS培養(yǎng)基中，不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的對照組和添加4號、9號或6號植物生長調(diào)節(jié)劑組合接種的完整胚有比較好的萌發(fā)效果。

2.5 添加植物生長調(diào)節(jié)劑處理油木奈種胚的萌發(fā)情況

匯總3種培養(yǎng)基都添加同一種植物生長調(diào)節(jié)劑組合的數(shù)據(jù)，見表6，添加了6號（2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA）的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對半敗育種胚和完整種胚都有最高的促進萌發(fā)效果，未添加植物生長調(diào)節(jié)劑的對照組半敗育種胚和完整種胚也有僅次于6號植物生長調(diào)節(jié)劑組合的效果。添加4號（0.1mg·L^-1IBA+0.1mg·L^-1NAA）植物生長調(diào)節(jié)劑組合有僅次于l號對照組的萌發(fā)效果。不管油木奈種胚的狀態(tài)如何，在對照組1號，6號（2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA）和4號（0.1mg·L^-1IBA+0.2mg·L^-1NAA）的組合下，種胚的萌發(fā)率是最高的。在種胚半敗育的狀態(tài)下，6號植物生長調(diào)節(jié)劑以及對照組l號，種胚的萌發(fā)率差異不顯著，但都高于4號植物生長調(diào)節(jié)劑的萌發(fā)率。在種胚完整飽滿的胚情況下，6號植物生長調(diào)節(jié)劑的萌發(fā)率卻大于1號和4號植物生長調(diào)節(jié)劑的萌發(fā)率。綜合來看，在實驗操作最方便和費用經(jīng)濟上可以選擇不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基，若添加植物生長調(diào)節(jié)劑，則可選擇6號或4號植物生長調(diào)節(jié)劑的組合。

3 討論

油櫬種胚嚴(yán)重敗育對油木奈的繁殖造成一定的影響，挽救即將敗育的種胚成為必要。在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的情況下，接種于SH培養(yǎng)基的完整種胚和半敗育種胚萌發(fā)率均為0.00%;接種于MS培養(yǎng)基的半敗育種胚和完整種胚的萌發(fā)率分別為0.00%和90.48%;接種于WPM培養(yǎng)基的半敗育種胚和完整種胚的萌發(fā)率分別為40.00%和100.00%。接種于WPM培養(yǎng)基油櫬種胚的萌發(fā)效果要好于MS培養(yǎng)基和SH培養(yǎng)基，這與萬春雁等的研究結(jié)果大致相同。這可能是WPM培養(yǎng)基為木本植物的培養(yǎng)基，比較適宜木本植物油櫬的種胚的萌發(fā)。接種于SH培養(yǎng)基的半敗育種胚的萌發(fā)率都比較低，SH培養(yǎng)基可能不適合油木奈半敗育種胚的萌發(fā)。在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑刺激的條件下，種胚的生長只有靠著培養(yǎng)基的營養(yǎng)和自身的營養(yǎng)儲備供給自身的萌發(fā)。在添加植物生長調(diào)節(jié)劑的條件下，完整胚的萌發(fā)率也基本保持著高于半敗育種胚萌發(fā)率的情況，這可能是因為完整的種胚中含有更適宜種胚生長的內(nèi)源激素以及更多貯存的營養(yǎng)物質(zhì)。

影響胚培育效果的因素很多，本試驗還有很多因素未能研究，例如胚齡、低溫培養(yǎng)天數(shù)、低溫培養(yǎng)溫度、除本試驗所研究的3種培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑以外的其他培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑組合的效果等。有研究表明胚齡越大，胚培成功率越高。本試驗只選用了一個時期的不同種胚類型進行胚培育，油櫬種胚隨著果實的發(fā)育，胚敗育逐漸增多，所以選擇合適的時間進行胚培育非常重要。不同胚齡的不同種胚類型的適宜培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑組合有待進一步研究。有人提出水解乳蛋白、酵母抽提液、活性炭對胚培育也有一定的影響。試驗過程中會發(fā)現(xiàn)較少量種胚褐化，這可能是因為種子中由于較高含量的酚類物質(zhì)，容易在胚培過程中褐化。有研究發(fā)現(xiàn)加入適量活性炭可以緩解種胚褐化的情況。核果類果樹幼胚培育難度大，將延緩胚敗育與胚挽救相結(jié)合，提高胚挽救的效率。

幼胚的胚培育是解決雜交胚敗育的有效途徑。胚培育既可以挽救油木奈種胚易敗育的特點，也可以挽救早熟品種因發(fā)育期短造成的種胚敗育或雜交育種不親和，為培育新品種打下基礎(chǔ)。油木奈種胚易敗育，易產(chǎn)生空腔都是制約油木奈長遠發(fā)展的因素。油棕種胚的敗育也受內(nèi)源激素的調(diào)控，添加合適的外源激素進行胚培育，有利于打破種子的休眠，促進種胚萌發(fā)。種胚敗育在許多植物中普遍存在并一直是研究的熱點，但種胚敗育機制尚不明確。除了對種胚敗育進行生理生化的研究，也需進一步加強對油木奈種胚敗育分子機理的研究，并對控制種胚敗育基因進行研究分析。此外，生產(chǎn)上也需加強對油櫬種胚敗育的控制性措施與試驗研究。

4 結(jié)論

接種于WPM培養(yǎng)基添加2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA（6號）的半敗育種胚都有著最高的萌發(fā)率，所以最適宜半敗育種胚萌發(fā)的培養(yǎng)基為添加2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA的WPM培養(yǎng)基。適合完整胚萌發(fā)的培養(yǎng)基為不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基，或添加1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA（2號）、2.0mg-L‘6-BA+0.2mg·L^-1NAA（3號）、2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA（6號）的WPM培養(yǎng)基。綜合來看，最適合油木奈種胚萌發(fā)的是添加2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA（6號）的WPM培養(yǎng)基。