甜瓜質(zhì)地差異及相關(guān)細(xì)胞壁酶活性變化

楊麗萍　馬榮雪　周永?！〕痰腔ⅰ∥捍喝A　張顯　張勇

摘 要： 對(duì)兩種不同質(zhì)地類型甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中果肉質(zhì)地的變化及相關(guān)酶活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，花后35～40 d為軟、脆兩種甜瓜質(zhì)地形成的關(guān)鍵時(shí)期。在該時(shí)期，軟肉型甜瓜‘NSL細(xì)胞面積與間隙增大，果肉細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞面積為脆肉型甜瓜的115.35%，軟肉型甜瓜‘NSL與脆肉型甜瓜‘XZM質(zhì)構(gòu)參數(shù)差異顯著，脆肉型甜瓜果實(shí)4種細(xì)胞壁酶活性總體低于軟肉型甜瓜?；ê?5 d，軟肉型甜瓜‘NSL細(xì)胞壁擴(kuò)展酶基因（CmEXP3、CmEXP5、CmEXP9）相對(duì)表達(dá)量為最大值，顯著高于脆肉型甜瓜‘XZM。

關(guān)鍵詞： 甜瓜;細(xì)胞形態(tài);質(zhì)地剖面分析;細(xì)胞壁酶;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S652? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? 文章編號(hào)：1673-2871（2020）05-012-06

Abstract： In this experiment， the changes of flesh texture and related enzyme activities during the development of two different texture types of melon fruits were studied. The results have shown that 35-40 d after pollination is the key period for the formation of soft and crisp melon texture. During this period， the cell area and intercellular space of the soft melon increased， and the flesh cells arranged loosely. The cell area of soft type fruit was 115.35% of crisp one. The structure parameters were significantly different. The four cell wall enzyme activities of crisp type were generally lower than those of soft one. At 35 days after pollination， the relative expression of the cell wall extension genes（CmEXP3， CmEXP5， CmEXP9） of the soft type ‘NSL was the highest， which was significantly higher than that of the crisp melon ‘XZM.

Key words： Melon; Cell morphology; Texture profile analysis; Cell wall enzyme; Gene expression

甜瓜質(zhì)地品質(zhì)是一個(gè)綜合性指標(biāo)，脆度和硬度是其兩大關(guān)鍵因子，甜瓜口感因之而有酥脆、梗硬、軟、面[1]的區(qū)別。影響質(zhì)地的因素有果肉細(xì)胞大小，細(xì)胞間結(jié)合力，細(xì)胞構(gòu)成物的機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞的膨壓等[2]，在果實(shí)成熟過程中，胞間層細(xì)胞壁酶對(duì)質(zhì)地有重要影響[3]。

TPA和穿刺法[4-5]能對(duì)甜瓜果實(shí)質(zhì)地進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，劉莉[1]等研究表明甜瓜質(zhì)構(gòu)參數(shù)與質(zhì)地相關(guān)。形態(tài)學(xué)研究表明[6]，果肉細(xì)胞的大小是甜瓜果實(shí)質(zhì)地影響因素之一，細(xì)胞越小，甜瓜果肉質(zhì)地越硬[7]，在蘋果、棗等[8-10]研究中有相同結(jié)論。在果實(shí)軟化過程中對(duì)其生理和分子機(jī)制也有相關(guān)研究[11-12]，細(xì)胞壁酶活性增強(qiáng)促進(jìn)果實(shí)軟化[13]。

脆肉型甜瓜是目前育種的方向，筆者研究5個(gè)不同甜瓜材料質(zhì)地差異的內(nèi)在因素，為脆肉型甜瓜育種及探究甜瓜質(zhì)地形成的機(jī)制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

5份試驗(yàn)材料（表1）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院選育，試驗(yàn)于2019年3—6月在陜西省咸陽市楊凌示范區(qū)西瓜試驗(yàn)示范基地進(jìn)行。每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，50穴育苗盤育苗，植株2葉1心定植，株距45 cm，行距80 cm，小區(qū)面積4 m2，每小區(qū)20株，按常規(guī)種植方法管理?；ê?5 d開始采樣，隨機(jī)采6個(gè)果形端正、大小一致且無病蟲害的果實(shí)。選擇5種甜瓜材料中口感差異明顯的脆肉型甜瓜材料‘XZM和軟肉型甜瓜材料‘NSL兩種材料探究果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期果肉細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)、果肉細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)、細(xì)胞壁擴(kuò)展酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化，探究包括‘XZM和‘NSL在內(nèi)的5種甜瓜材料果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期果肉細(xì)胞壁酶活性的變化。

1.2 方法

1.2.1 TPA法 參照劉莉[1]等的方法，有改進(jìn)。沿甜瓜果實(shí)赤道橫向切成厚度約1.0 cm的薄片，果實(shí)切薄片去皮，去瓤，留下可食用部分果肉，用直徑0.8 cm的打孔器，用力方向?yàn)榇怪庇诒∑蚩?，將柱狀果肉高度修飾?.8 cm，置于TA. XT. Plus物性分析儀（英國Stable Micro System公司）的平板上，采用P/75探頭（Φ 75 mm壓板），設(shè)置測試參數(shù)條件如下：預(yù)壓速度2.0 mm·s-1，下壓速度3.0 mm·s-1，壓后上行速度3.0 mm·s-1，2次壓縮間停頓3.0 s，試樣受壓形變30.0%，觸發(fā)力10.0 g。

1.2.2 穿刺法 參照劉莉[1]等的方法，有改進(jìn)。果肉取樣方法與 TPA 法一致，樣品采用直徑為1.6 cm的打孔器進(jìn)行打孔，圓柱厚度約為2.0 cm。將果肉置于物性分析儀的測試平板上，采用 P/2 探頭（Φ 2 mm 不銹鋼圓柱探頭），測試參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)壓速度5.0 mm·s-1，下行速度 2.0 mm·s-1，穿刺后上行速度2.0 mm·s-1，下壓距離為10.0 mm，觸發(fā)力10.0 g。

1.2.3 果肉細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察 將新鮮組織用固定液固定24 h以上，依次梯度酒精進(jìn)行脫水，將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋，修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片，厚4 μm，石蠟切片脫蠟至水，最后將植物組織切片放入染液約2～5 min后水洗，鏡檢。

1.2.4 細(xì)胞壁酶活性的測定 酶液的提取參照曹建康等[14]的方法，有改進(jìn)。PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性（以鮮質(zhì)量計(jì)，后同）及Cx（纖維素酶）活性用DNS（3，5-二硝基水楊酸）比色法[15]測定;β-Gal（β-半乳糖苷酶）活性用硝基半乳糖苷水解法[16-17]測定;PME（果膠甲酯酶）活性參照曾秀麗等[18]及張娟等[19]的方法測定。

1.2.5 細(xì)胞壁擴(kuò)展酶基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測 采用TaKaRa多糖多酚試劑盒提取果肉總RNA（有改進(jìn)），所提取的總RNA于UV-1700紫外分光光度計(jì)測定 A260、A280、A230，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA質(zhì)量和完整性。采用 Primer 5.0軟件進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(jì)，引物序列如表2。使用TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，RNA模板量為1 000 ng。PCR反應(yīng)總體積10.0 μL，其中包括2.0 μL模板（cDNA），0.2 μL特異引物，5.0 μL SYBR? Premix Ex TaqTM（2×），2.6 μL ddH2O補(bǔ)齊。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，引物序列如表2。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用Image-pro plus 6.0軟件對(duì)果肉組織切片進(jìn)行圖像分析，獲得細(xì)胞形態(tài)學(xué)相關(guān)參數(shù);使用SPSS 22.0軟件對(duì)質(zhì)地參數(shù)及細(xì)胞形態(tài)參數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;使用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種質(zhì)地甜瓜發(fā)育過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在甜瓜發(fā)育不同時(shí)期，不同類型甜瓜的細(xì)胞大小、排列方式存在差異，在甜瓜果實(shí)發(fā)育時(shí)期細(xì)胞增大（圖1）?；ê?5 d到25 d，‘NSL果肉細(xì)胞小，細(xì)胞排列緊密，褶皺多，隨著果實(shí)發(fā)育成熟，細(xì)胞增大，相同視野下細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞褶皺減少，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞排列疏松。成熟期軟肉型甜瓜‘NSL的細(xì)胞比酥脆型果肉甜瓜‘XZM的大，且排列整齊不一，較疏松，細(xì)胞間隙較大，‘XZM細(xì)胞較圓，細(xì)胞壁褶皺較少。軟肉型甜瓜‘NSL花后40 d細(xì)胞大小和間隙增大，排列疏松。綜上所述，甜瓜果肉的質(zhì)地受細(xì)胞形態(tài)、排列方式的影響。

2.2 兩種質(zhì)地甜瓜發(fā)育過程中的細(xì)胞形態(tài)相關(guān)參數(shù)的變化

不同細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期變化趨勢不同（表3）。細(xì)胞形態(tài)參數(shù)變化趨勢無細(xì)胞大小參數(shù)明顯，花后40 d，軟肉型甜瓜材料‘NSL與酥脆型甜瓜材料‘XZM細(xì)胞大小和細(xì)胞形態(tài)等6個(gè)細(xì)胞相關(guān)參數(shù)差異均顯著，兩種材料細(xì)胞長度總體呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，花后35～40 d，‘NSL細(xì)胞大小的增長趨勢高于‘XZM，細(xì)胞圓度總體呈逐漸減小的趨勢，縱橫比呈逐漸增大的趨勢。

2.3 兩種質(zhì)地甜瓜發(fā)育過程中質(zhì)構(gòu)參數(shù)的變化

甜瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期不同口感材料其質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化不同（表4）。脆肉型材料‘XZM果實(shí)發(fā)育各個(gè)時(shí)期變化不明顯，軟肉型材料TPA硬度呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，花后35～40 d的下降趨勢明顯，花后40 d為最小值358.96 g，與‘XZM差異顯著?；ê?0 d，‘NSL的咀嚼性與‘XZM差異顯著，‘NSL的咀嚼性為各個(gè)時(shí)期的最小值（64.53 g），‘XZM是其9.84倍?；ê?5 d，‘XZM的黏附力與各個(gè)時(shí)期差異顯著。‘XZM的穿刺硬度呈先升高后降低的趨勢，‘NSL的穿刺硬度呈下降趨勢。

2.4 甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中果肉細(xì)胞壁酶活性的變化

由圖2可知，不同口感類型甜瓜在發(fā)育、成熟不同時(shí)期，細(xì)胞壁酶活性有所不同，同一材料甜瓜在發(fā)育、成熟不同時(shí)期，質(zhì)地相關(guān)酶酶活性不同。PG活性在甜瓜花后15～35 d，其變化規(guī)律不明顯，在花后35～40 d，5種材料PG活性均呈上升趨勢，且軟肉型甜瓜比脆肉型甜瓜的上升趨勢明顯。Cx活性在花后15～35 d總體呈逐漸上升趨勢，花后35～40 d呈下降趨勢，且軟肉型甜瓜的下降趨勢比脆肉型甜瓜的明顯。β-Gal活性在軟肉型甜瓜中總體呈上升趨勢，花后30 d起，上升趨勢增大，在脆肉型甜瓜，花后15～20 d呈上升趨勢，花后20～40 d呈下降趨勢。PME活性在軟肉型甜瓜中呈逐漸下降趨勢，且軟肉型甜瓜中的PME活性在花后15～40 d的任一時(shí)期均比脆肉型的高，脆肉型甜瓜PME活性呈先升高后下降的趨勢，花后15～20 d呈上升趨勢，20～40 d呈下降趨勢。以上結(jié)果表明，果實(shí)質(zhì)地的變化受多種酶共同影響，不同細(xì)胞壁酶在果實(shí)發(fā)育成熟不同時(shí)期發(fā)揮作用。

2.5 細(xì)胞壁擴(kuò)展酶基因的表達(dá)分析

由圖3可知，CmEXP3、CmEXP5、CmEXP9的相對(duì)表達(dá)量在‘XZM和‘NSL果實(shí)發(fā)育、成熟不同時(shí)期均高于CmEXP6，花后35 d的相對(duì)表達(dá)量增加，與各時(shí)期差異顯著。CmEXP3、CmEXP9的相對(duì)表達(dá)量在脆肉型甜瓜材料‘XZM中總體呈先升高后降低的趨勢，花后25 d相對(duì)表達(dá)量降低?；ê?5 d，‘NSL的CmEXP3、CmEXP9的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，花后35 d達(dá)到最大值，分別為花后15 d的17.8倍和7.94倍，花后40 d的表達(dá)量下降，但相對(duì)表達(dá)量均高于花后35 d前的各個(gè)時(shí)期，且相對(duì)表達(dá)量均高于 ‘XZM。CmEXP5的相對(duì)表達(dá)量在花后35 d顯著增加，達(dá)到最大值，為花后15 d的2.74倍。CmEXP6的相對(duì)表達(dá)量在兩材料各個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量較低，總體呈下降趨勢。綜上所述，花后35 d為細(xì)胞壁擴(kuò)展酶基因表達(dá)的關(guān)鍵時(shí)期。

3 討論與結(jié)論

筆者對(duì)脆肉型甜瓜材料‘XZM和軟肉型甜瓜材料‘NSL果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的果肉細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)、果肉細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行了研究?；ê?5～25 d，細(xì)胞增大較為明顯，該時(shí)期為甜瓜果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)積累時(shí)期。軟肉型甜瓜花后40 d細(xì)胞大小和間隙增大，排列疏松。甜瓜果肉的質(zhì)地受到細(xì)胞形態(tài)、排列方式的影響，這與李三培等[7]在甜瓜上的研究結(jié)果一致?？墒褂脪呙桦婄R對(duì)果肉組織自然斷裂面觀察，進(jìn)一步研究‘XZM和‘NSL的果肉組織自然斷裂模式對(duì)甜瓜質(zhì)地的影響。通過質(zhì)構(gòu)剖面分析測定花后15～40 d每隔5 d各個(gè)時(shí)期的質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化，花后35～40 d為軟肉型甜瓜質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化的關(guān)鍵時(shí)期。

對(duì)口感不同的甜瓜材料細(xì)胞壁酶活性的研究結(jié)果表明，果實(shí)質(zhì)地的變化受多種酶共同影響，不同細(xì)胞壁酶在果實(shí)發(fā)育、成熟不同時(shí)期發(fā)揮作用，可進(jìn)一步探究甜瓜質(zhì)地形成過程中的關(guān)鍵酶。張娟等[19]在蘋果中研究表明，PG和PME是‘秦冠果實(shí)質(zhì)地變化的關(guān)鍵酶，而β-Gal在‘富士質(zhì)地變化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。細(xì)胞壁擴(kuò)展酶基因表達(dá)量變化研究表明，甜瓜質(zhì)地的形成受多個(gè)細(xì)胞壁擴(kuò)展酶基因共同調(diào)控，花后35 d為細(xì)胞壁擴(kuò)展酶基因表達(dá)的關(guān)鍵時(shí)期，這與果實(shí)質(zhì)構(gòu)或許在其發(fā)育階段就已經(jīng)被決定了[21]的研究結(jié)果一致。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，花后35～40 d為甜瓜質(zhì)地形成的關(guān)鍵時(shí)期，可以從質(zhì)地差異形成生理、分子機(jī)制方面對(duì)這一時(shí)期深入研究。甜瓜種質(zhì)資源豐富[22]，口感質(zhì)地多樣，筆者取材感官上有區(qū)別的軟肉和脆肉材料，二者之間細(xì)胞壁相關(guān)酶活性分析未見顯著差異，因此對(duì)甜瓜質(zhì)地研究還需從感官評(píng)價(jià)、質(zhì)構(gòu)等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

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