風(fēng)味蛋白酶水解藍(lán)圓鲹工藝及酶解液抗氧化活性初探

黃茂坤，林志杰

食源性海洋生物資源是當(dāng)下食品科學(xué)界研究開發(fā)的熱門對(duì)象.藍(lán)圓鲹，俗稱“巴浪魚”，是東南沿海常見的低值漁獲產(chǎn)品，捕撈量大，但由于易腐爛、不耐貯藏，鮮銷少，常加工為魚干［1］，甚至直接制作成飼料，加工水平有待提升.據(jù)研究［2］，藍(lán)圓鲹魚肉中含有人體必需的氨基酸，包括嬰兒必需的組氨酸，是一種優(yōu)質(zhì)的海洋生物資源.生物酶解技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、高效、環(huán)保、便于操作等優(yōu)點(diǎn)，可作為藍(lán)圓鲹高值化開發(fā)利用的主要技術(shù)手段，比如利用某些蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹進(jìn)行酶解處理后，可將藍(lán)圓鲹蛋白水解成小分子多肽或徹底水解成氨基酸，水解液可以進(jìn)一步開發(fā)為海鮮風(fēng)味飲料、抗氧化活性肽等高附加值產(chǎn)品，特別是抗氧化活性肽產(chǎn)品，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，蔣海萍等［3］的研究表明，藍(lán)圓鲹多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性.本試驗(yàn)從高值化加工的角度出發(fā)，采用風(fēng)味蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹進(jìn)行水解處理，在優(yōu)化pH、水解溫度、酶添加量、料液比等工藝條件的基礎(chǔ)上，初步探究了藍(lán)圓鲹風(fēng)味蛋白酶水解液的體外抗氧化活性.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

藍(lán)圓鲹，市售；風(fēng)味蛋白酶（食品級(jí)，江蘇銳陽生物科技有限公司）；氫氧化鈉（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；甲醛（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；硼酸（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；鹽酸（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；乙醇（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；甲基紅（IND，西隴科學(xué)股份有限公司）；亞甲基藍(lán)（IND，西隴科學(xué)股份有限公司）；過氧化氫（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；硫酸銅（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；硫酸（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；硫酸鉀（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（98%，上海源葉生物科技有限公司）；水楊酸（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；硫酸亞鐵（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；雙氧水30%（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）.

1.2 儀器與設(shè)備

J330 型絞肉機(jī)（奧克斯集團(tuán)）；JYL-C012型多功能料理機(jī)（九陽股份有限公司）；HYP-308 型消化爐（上海纖檢儀器有限公司）；KDN-103F 型自動(dòng)凱氏定氮儀（上海纖檢儀器有限公司）；AL104-IC 型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；PE20 型PH 計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；SHB-Ⅲ磁力攪拌水浴鍋（金壇市良友儀器有限公司）；78HW-1 型恒溫磁力攪拌器（金壇市憶通電子有限公司）；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）.

1.3 試驗(yàn)方法

（1）原料處理.將藍(lán)圓鲹內(nèi)臟去除，清洗后瀝干，絞碎拌勻，按一定質(zhì)量分裝好并置于-18 ℃冰箱中保存.

（2）工藝流程.取預(yù)先分裝好的原料一份→解凍后加入原料質(zhì)量1 倍的蒸餾水，置于料理機(jī)中勻漿→稱取一定質(zhì)量勻漿后的原料→按酶解工藝的料液比要求補(bǔ)齊蒸餾水→按酶解工藝要求調(diào)節(jié)pH→按工藝要求的添加量加入風(fēng)味蛋白酶（本試驗(yàn)風(fēng)味蛋白酶添加量均以解凍后的藍(lán)圓鲹原料質(zhì)量為基數(shù)）→置于預(yù)先設(shè)置好溫度的磁力攪拌水浴鍋中恒溫酶解一段時(shí)間→于95 ℃水浴中加熱處理10 min進(jìn)行滅酶→冷卻后離心處理→按規(guī)范獲取上清液，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定.

（3）風(fēng)味蛋白酶水解藍(lán)圓鲹工藝的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì).本試驗(yàn)以藍(lán)圓鲹蛋白水解度作為優(yōu)化酶解工藝條件的考察指標(biāo)，將風(fēng)味蛋白酶水解時(shí)間固定為4 h，分別考察pH、水解溫度、酶添加量、料液比四個(gè)因素對(duì)酶解效果的影響，每組試驗(yàn)平行做三次，試驗(yàn)結(jié)果取平均值，具體設(shè)計(jì)如下：

①將風(fēng)味蛋白酶添加量、水解溫度、料液比分別固定設(shè)置為3.5%、55 ℃、1∶6，考察pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 時(shí)風(fēng)味蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的水解效果.

②將風(fēng)味蛋白酶添加量、pH、料液比分別固定設(shè)置為3.5%、6.0、1∶6，考察風(fēng)味蛋白酶水解溫度為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃時(shí)風(fēng)味蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的水解效果.

③將風(fēng)味蛋白酶水解溫度、pH、料液比分別固定設(shè)置為55 ℃、6.0、1∶6，考察風(fēng)味蛋白酶添加量為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%時(shí)風(fēng)味蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的水解效果.

④將風(fēng)味蛋白酶添加量、水解溫度、pH 分別固定設(shè)置為3.5%、55 ℃、6.0，考察水解體系料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 時(shí)風(fēng)味蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的水解效果.

（4）風(fēng)味蛋白酶水解藍(lán)圓鲹工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì).本試驗(yàn)不考慮工藝條件的交互作用，以藍(lán)圓鲹蛋白水解度為考察指標(biāo)，在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定出pH（A）、水解溫度（B）、酶添加量（C）、料液比（D）四個(gè)因素的水平范圍（見表1），采用L16（45）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，于水解時(shí)間為4 h 的條件下進(jìn)一步優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解藍(lán)圓鲹蛋白的工藝條件.

表1 L16（45）正交試驗(yàn)因素水平表

（5）藍(lán)圓鲹蛋白酶解液體外抗氧化活性試驗(yàn)設(shè)計(jì).本試驗(yàn)在上述酶解工藝條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將風(fēng)味蛋白酶水解工藝的pH、水解溫度、酶添加量、料液比分別固定設(shè)置為6.0、55 ℃、3.5%、1∶6，以DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，考察不同酶解時(shí)間1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 處理藍(lán)圓鲹蛋白后其酶解液體外抗氧化活性的變化情況.

1.4 指標(biāo)測定方法

（1）總氮含量的測定.采用GB5009.5-2016 凱式定氮法測定總氮含量.

（2）氨基態(tài)氮含量的測定.采用甲醛電位滴定法［4］測定氨基態(tài)氮含量.

（3）水解度的計(jì)算公式［5］.

（4）DPPH 自由基清除率的測定［6］.以95%乙醇溶解DPPH，配成濃度為10 mmol/L 的溶液.在分光光度計(jì)上以2 mL 樣品液與2 mL 95%乙醇混勻后的溶液調(diào)零，取2 mL 樣液與2 mL DPPH 溶液混合搖勻，室溫下避光放置30 min 后測517 nm 處的吸光度，記為A樣.空白管以95%乙醇代替樣品，測定吸光度，記為A空.每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次，取平均值.

2 結(jié)果

2.1 風(fēng)味蛋白酶水解工藝試驗(yàn)結(jié)果

（1）單因素試驗(yàn)結(jié)果分析.

①pH 對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解效果的影響.以測得的藍(lán)圓鲹蛋白水解度為縱坐標(biāo)，以風(fēng)味蛋白酶水解體系的pH 為橫坐標(biāo)，繪制水解度與pH 的關(guān)系曲線，如圖1 所示，隨著pH 的增長，風(fēng)味蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的水解效果呈先升高后降低的趨勢，水解效果最佳時(shí)pH 為6.0.從試驗(yàn)結(jié)果可知，pH 對(duì)風(fēng)味蛋白酶催化活性的發(fā)揮具有一定的影響，因?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶本身是一種蛋白質(zhì)，具有兩性性質(zhì)，其所處溶液的酸堿性（即pH 高低）會(huì)使其解離情況發(fā)生變化，從而影響其催化活性.

圖1 pH 對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解度的影響

②水解溫度對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解效果的影響.以測得的藍(lán)圓鲹蛋白水解度為縱坐標(biāo)，風(fēng)味蛋白酶水解溫度為橫坐標(biāo)，繪制水解溫度與水解度的關(guān)系曲線，如圖2 所示，在40～55 ℃的溫度范圍內(nèi)，風(fēng)味蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的水解度隨著溫度的升高而升高，超過55 ℃開始呈下降趨勢，說明在催化水解藍(lán)圓鲹蛋白的過程中，55 ℃左右是風(fēng)味蛋白酶發(fā)揮催化活性的適合溫度條件，偏離這個(gè)溫度太遠(yuǎn)，會(huì)影響風(fēng)味蛋白酶催化活性的發(fā)揮，降低水解效果.

圖2 水解溫度對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解度的影響

③酶添加量對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解效果的影響.以測得的藍(lán)圓鲹蛋白水解度為縱坐標(biāo)，風(fēng)味蛋白酶添加量為橫坐標(biāo)，繪制酶添加量與水解度的關(guān)系曲線，如圖3 所示，風(fēng)味蛋白酶的水解效果隨著酶添加量的增加而呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，當(dāng)酶添加量為3.5%時(shí)，藍(lán)圓鲹蛋白水解度達(dá)到峰值，當(dāng)酶添加量超過3.5%以后，藍(lán)圓鲹蛋白水解度變化開始趨緩甚至略有下降，說明在其他酶解條件固定的情況下，改變風(fēng)味蛋白酶添加量可以改變其對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的水解效果，并且存在一個(gè)最佳值，超過最佳值，風(fēng)味蛋白酶反而會(huì)抑制自身對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的催化水解作用，導(dǎo)致水解度降低.

圖3 酶添加量對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解度的影響

④料液比對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解效果的影響.以測得的藍(lán)圓鲹蛋白水解度為縱坐標(biāo)，風(fēng)味蛋白酶水解體系料液比為橫坐標(biāo)，繪制料液比與水解度的關(guān)系曲線，如圖4 所示，隨著反應(yīng)體系加液量的升高，藍(lán)圓鲹蛋白水解度呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)料液比為1∶6 時(shí)，風(fēng)味蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的水解效果最好，原因可能是：在磁力攪拌作用下的液體反應(yīng)體系中，風(fēng)味蛋白酶與藍(lán)圓鲹原料顆粒要碰觸在一起才能發(fā)生水解反應(yīng)，反應(yīng)體系的液體量過多或過少都不利于他們充分接觸，從而影響水解效果.

圖4 料液比對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解度的影響

（2）正交試驗(yàn)結(jié)果分析.風(fēng)味蛋白酶水解藍(lán)圓鲹蛋白的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析（見表3）可知，風(fēng)味蛋白酶水解藍(lán)圓鲹蛋白的4 個(gè)工藝條件的最佳組合為A2B3C2D3，即pH=6.0、水解溫度為55 ℃、酶添加量為3.5%、料液比為1∶6.對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（見表4）可知，四個(gè)試驗(yàn)因素均對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小為：A（pH）＞D（料液比）＞C（酶添加量）＞B（水解溫度）.在酶解時(shí)間為4 h 的條件下，采用上述最佳工藝水解藍(lán)圓鲹樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得藍(lán)圓鲹蛋白水解度為38.71%.

2.2 藍(lán)圓鲹蛋白酶解液體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 極差分析結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

表5 不同水解時(shí)間對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白水解度及酶解液抗氧化活性的影響

DPPH 自由基是一種很穩(wěn)定的氮中心自由基，常用于抗氧化成分的體外抗氧化性評(píng)價(jià)，DPPH 自由基清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)［7］.從表5 可知，隨著水解時(shí)間的延長，藍(lán)圓鲹蛋白水解度逐漸升高，但4 h 以后變化開始趨緩，為此，本試驗(yàn)只選取水解時(shí)間為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 的酶解液測定DPPH 自由基清除率.結(jié)果表明，水解時(shí)間為3 h 的藍(lán)圓鲹蛋白酶解液的DPPH 自由基清除率最大，DPPH 自由基清除率與水解度之間并無明顯作用規(guī)律，這可能是因?yàn)槊附庖嚎寡趸钚耘c其中所含小分子多肽上的基團(tuán)有關(guān)，隨著水解時(shí)間的推進(jìn)，在提高藍(lán)圓鲹蛋白水解度的同時(shí)，其蛋白質(zhì)分子被分解為小分子多肽的情況也在發(fā)生變化，因此呈現(xiàn)出抗氧化活性不同的現(xiàn)象.

3 討論與結(jié)論

近年來，國內(nèi)外諸多學(xué)者研究利用蛋白酶酶解海洋低值魚，實(shí)現(xiàn)海洋低值蛋白資源高值化，積累了一些技術(shù)經(jīng)驗(yàn)［8］.在借鑒相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)在水解時(shí)間為4 h 的條件下，對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解藍(lán)圓鲹蛋白的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳組合：pH=6.0、水解溫度為55 ℃、酶添加量為3.5%、料液比為1∶6，采用該工藝條件水解處理藍(lán)圓鲹蛋白，水解度為38.71%.研究表明，許多生物活性肽在母體蛋白中不一定具有活性，但在體外采用生物酶解等方法處理后，一些具有抗氧化活性的肽片段就會(huì)被釋放［9］.本試驗(yàn)固定pH=6.0、水解溫度55 ℃、酶添加量3.5%、料液比1∶6，考察了不同水解時(shí)間條件下藍(lán)圓鲹蛋白水解度與酶解液DPPH 自由基清除率的變化情況，發(fā)現(xiàn)DPPH 自由基清除率的變化與水解度的變化無明顯的相關(guān)性，但藍(lán)圓鲹風(fēng)味蛋白酶水解液具有一定的體外抗氧化活性，其DPPH 自由基清除率的最大值為80.19%.試驗(yàn)初步證明，采用風(fēng)味蛋白酶水解處理藍(lán)圓鲹，其產(chǎn)物可作為開發(fā)抗氧化活性肽產(chǎn)品的潛在資源，未來可對(duì)該酶解產(chǎn)物的其他體外抗氧化活性指標(biāo)和體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行深入研究，以期為藍(lán)圓鲹高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)參考.