氧化應(yīng)激介導(dǎo)NLRP3炎性反應(yīng)小體對(duì)慢性阻塞性肺疾病的影響研究

劉 萍 婁 可 文 隆 李 慧 湯渝玲

(長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410035)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 是以持續(xù)氣流受限為特征的疾病，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺對(duì)有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。COPD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激在COPD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3(nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3)炎性反應(yīng)小體功能失調(diào)是慢性氣道疾病、肺纖維化等多種呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵調(diào)控因素。NLRP3炎性反應(yīng)小體激活的相關(guān)分子機(jī)制十分復(fù)雜，研究[1]顯示活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增多，并通過(guò)ROS依賴的信號(hào)通路可以促進(jìn)NLRP3炎性反應(yīng)小體的聚集及活化。本研究擬觀察氧化應(yīng)激和NLRP3炎性反應(yīng)小體在COPD患者不同狀態(tài)下的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2018年6月于長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院住院的COPD患者90例。其中慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)患者60例，男性34例，女性26例，年齡(68.15±7.12)歲。其中AECOPD組患者根據(jù)肺功能結(jié)果，將AECOPD組分為兩組：(1)重-極重組30例，男性18例，女性12例，平均年齡(70.23±6.56)歲。(2)輕-中組30例，男性13例，女性17例，平均年齡(69.25±5.06)歲。急性加重期患者經(jīng)治療癥狀體征好轉(zhuǎn)達(dá)到緩解期水平后作為COPD穩(wěn)定期組，共30例，男性19例，女性11例，平均年齡(71.53.15±4.16)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)COPD 診斷符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南 (2017 年修訂版)》[1]標(biāo)準(zhǔn);(2)近 1 個(gè)月內(nèi)無(wú)糖皮質(zhì)激素等藥物治療 ;(3)意識(shí)清楚，無(wú)認(rèn)知障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 合并肺癌、肺結(jié)核、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、氣胸、肺膿腫等肺部疾病者;(2) 合并心力衰竭者;(3)多發(fā)肺大泡、咯血、近期胸腹手術(shù)等不宜行肺功能檢查患者；(4)長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素治療者。

選取同期門診健康體檢者共30例作為對(duì)照組，平均年齡(67.16±3.08)歲。胸部影像學(xué)檢查和肺功能檢查正常，肝、腎功能正常，排除慢性呼吸系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病等，近4周無(wú)呼吸道感染史。本研究經(jīng)長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

352 型酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan公司)，AC-8洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems公司)，TG16W離心機(jī)(中國(guó)武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，HP-Deskjet 3748肺功能儀(德國(guó)耶格公司)，PIKO REAL 96熒光定量RCP儀(美國(guó)Thermo公司)。 磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline，PBS)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，人淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)Solarbio公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，Tris(美國(guó)Sigma公司)，UltraSYBR Mixture(中國(guó)北京康為世紀(jì)公司)，EDTA(美國(guó)Sigma公司)，DEPC(美國(guó)Sigma公司)，E.B.(美國(guó)Sigma公司)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 試劑盒購(gòu)自日本TakaRa公司(上海生工生物公司合成所需引物)，聚合酶鏈反應(yīng) (transcription-polymerase chain reaction，PCR) 所需試劑由美國(guó) Invitrogen 公司提供，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 試劑盒購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)、氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)濃度

采集所有受試者清晨空腹外周血5 mL，轉(zhuǎn)速設(shè)置為3 000 r/min，離心10 min，取上層清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，顯色后在352 型酶標(biāo)儀下450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的吸光度(A)值，根據(jù)A值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣本濃度。

1.2.3 標(biāo)本采集與人外周血淋巴細(xì)胞分離

(1)采用含有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA) 的真空采血管，將受試者清晨空腹外周血5 mL置于其中，放置于4 ℃溫度下保存；(2)在離心管中加入3 mL分離液，將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰；(3)室溫，水平轉(zhuǎn)子1 000g，離心20 min；(4)離心后會(huì)出現(xiàn)分層：從上至下依次為稀釋的血漿層、白膜樣的淋巴細(xì)胞層、透明的分離液層、紅細(xì)胞與粒細(xì)胞層。(5)緩慢地將白膜層細(xì)胞吸取到15 mL潔凈的離心管中，使用10 mL PBS洗滌白膜層細(xì)胞。250g，離心10 min；(6)棄上清，5 mL的PBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250 g，離心10 min。 此步驟重復(fù)兩次；(7)棄上清，細(xì)胞重懸備用。

1.2.4 RNA 提取及RT-PCR

(1)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，向細(xì)胞中加入1 mL Trizol充分吹打，混勻后室溫裂解3 min。加入0.2倍體積的三氯甲烷，振蕩，室溫靜置3～5 min；在4 ℃下，12 000 r/min離心15 min。取上層液相，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min；12 000 r/min在4 ℃下離心10 min，去上清，沉淀中加入1 mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，震蕩儀器；12 000 r/min在4 ℃下離心5 min，去上清，在空氣中干燥5～10 min；加入30～50 μL無(wú)菌DEPC處理水溶解，去除沉淀；用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，吸取2 μL RNA溶液于石英比色皿中，用無(wú)酶水定容至100 μL，在260 nm與280 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度值，并計(jì)算其濃度跟純度。(2)RT-PCR采用SYBR法，反應(yīng)體系20 μL/孔，包括dNTP混合液，2.5 mmol/L 4 μL、混合引物2 μL、RNA 模板 3 μL、5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 μL、雙蒸水 0.1 mol/L 2 μL、HiFiScript反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL、無(wú)酶水 4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min進(jìn)入主循環(huán)，其中95 ℃預(yù)變性 15 s，60 ℃變性60 s，經(jīng)40個(gè) 循環(huán); 記錄循環(huán)次數(shù)(CT值)，并計(jì)算NLRP3 mRNA表達(dá)量。NLRP3正向引物序列為5′-CCGCCATGTACTACCTGCT-3′，反向引物序列為 5′-ACCCCTTTTCGAATTTGCCAT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為 212 bp。

1.2.5 肺功能測(cè)定

AECOPD患者在癥狀體征緩解達(dá)到緩解期水平后行肺功能檢測(cè)。所有受試者行肺功能檢測(cè)前均需停用短效支氣管擴(kuò)張劑12 h以上，長(zhǎng)效支氣管擴(kuò)張劑24 h以上。檢測(cè)指標(biāo)包括1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in the first second，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、一秒率(FEV1/FVC)、FEV1占預(yù)計(jì)值百分比(forced expiratory volume in the first second % pred，F(xiàn)EV1 %)，測(cè)量3次取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清中MDA、SOD濃度,NLRP3 mRNA表達(dá)量比較

血清中MDA濃度AECOPD組高于COPD穩(wěn)定期組、COPD穩(wěn)定期組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清中SOD濃度AECOPD組低于COPD穩(wěn)定期組、COPD穩(wěn)定期組低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；外周血淋巴細(xì)胞中NLRP3 mRNA表達(dá)量AECOPD組高于COPD穩(wěn)定期組、COPD穩(wěn)定期組高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

AECOPD血清中MDA濃度重-極重組高于輕-中組、輕-中組高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AECOPD血清中SOD濃度重-極重組低于輕-中組、輕-中組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AECOPD外周血淋巴細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)量重-極重組高于輕-中組、輕-中組高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表1 AECOPD組、COPD穩(wěn)定期組、對(duì)照組血清中MDA和SOD濃度和NLRP3 mRNA表達(dá)量

Group Number of caseMDA/(ng·mL-1)SOD/(nmol·L-1)NLRP3Control30651.73±50.721 423.45±72.36 1.08±0.19AECOPD60861.32±51.22?# 1 160.20±110.15?# 9.46±3.26?#COPD stable period30796.50±65.83? 1 377.81±85.49? 4.67±0.41?F 144.8795.56137.78P 0.0000.0000.000

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsCOPD stable period group.AECOPD：acute chronic obstructive pulmonary disease;COPD：chronic obstructive pulmonary disease；MDA： malondialdehyde;SOD： superoxide dismutase;NLRP3：nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3.

表2 AECOPD肺功能重-極重組、輕-中組和健康對(duì)照組的MDA、SOD濃度和NLRP3 mRNA表達(dá)量

Group Number of caseMDA/(ng·mL-1)SOD/(nmol·L-1)NLRP3Control30651.73±50.721 377.81±85.491.078±0.20Weight-very restructuring30898.20±22.50?#1 053.82±14.29?#12.50±1.14?#Light-medium30824.45±44.91?1 266.59±32.64?6.41±1.10?F 282.648284.3471 158.859P 0.0000.0000.000

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vslight-medium group.AECOPD：acute chronic obstructive pulmonary disease;MDA： malondialdehyde；SOD： superoxide dismutase;NLRP3：nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3.

2.2 COPD患者血清中MDA和SOD濃度、外周血淋巴細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)量、FEV1% pred之間的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，COPD患者血清MDA濃度與NLRP3 mRNA 表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.64,P<0.05)；COPD患者中血清SOD濃度與NLRP3 mRNA 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=0.90,P<0.05)；COPD患者FEV1%pred與NLRP3 mRNA 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)數(shù)(r=-0.78,P<0.05)。

3 討論

COPD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激在COPD的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。機(jī)體遭受到各種外界有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如ROS和活性氮自由基產(chǎn)生過(guò)多，氧化程度的速度超過(guò)了氧化物的自然代謝速度，導(dǎo)致體內(nèi)的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引發(fā)組織損傷。

研究[2-4]顯示，NLRP3炎性反應(yīng)小體在氣道慢性炎性反應(yīng)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。COPD患者氣道和肺部許多內(nèi)源性NLRP3激活劑濃度升高。NLRP3炎性反應(yīng)小體屬于胞質(zhì)型模式識(shí)別受體[2]，它是主要的固有免疫感受器[3]。機(jī)體接受外源性或內(nèi)源性刺激時(shí)，病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)及損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，并通過(guò)ROS依賴的信號(hào)通路促進(jìn)NLRP3炎性反應(yīng)小體的聚集及活化[4]。一旦NLRP3激活，將與ASC相結(jié)合，進(jìn)一步募集pro-caspase-1，并誘導(dǎo)pro-caspase-1進(jìn)行自我剪切生成活化的caspase-1?；罨腸aspase-1促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β和 IL-18的剪切成熟和分泌，從而激活下游的炎性反應(yīng)。

NLRP3炎性反應(yīng)小體功能失調(diào)是慢性氣道疾病、肺纖維化等多種呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵調(diào)控因素[5-8]。NLRP3炎性反應(yīng)小體激活的相關(guān)分子機(jī)制十分復(fù)雜，近年研究[9-12]顯示，ROS產(chǎn)生增多，并通過(guò)ROS依賴的信號(hào)通路可能促進(jìn)NLRP3炎性反應(yīng)小體的聚集及活化，NLRP3炎性反應(yīng)小體的聚集及活化引起肺部及全身炎性反應(yīng)，對(duì)慢性阻塞性肺疾病進(jìn)程產(chǎn)生影響。

本研究中，血清MDA濃度AECOPD組高于COPD穩(wěn)定期組、COPD穩(wěn)定期組高于對(duì)照組(P<0.05)；血清SOD濃度AECOPD組低于COPD穩(wěn)定期組、COPD穩(wěn)定期組低于對(duì)照組(P<0.05)。這與Bartoli等[5]的研究結(jié)果一致,這提示體內(nèi)氧化與抗氧化失衡刺激黏液高分泌、炎性反應(yīng)因子激活和血漿滲出增加，形成慢性阻塞性肺疾病。AECOPD重-極重組MDA濃度高于輕-中組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AECOPD重-極重組SOD濃度低于輕-中組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與Keranis等[13]的研究結(jié)果一致,這提示體內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)可能對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者的肺功能產(chǎn)生影響，從而影響慢性阻塞性肺疾病的疾病嚴(yán)重程度。

AECOPD組、COPD穩(wěn)定期中的NLRP3 mRNA表達(dá)量均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AECOPD組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量高于COPD穩(wěn)定期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在COPD患者中NLRP3 mRNA表達(dá)量增高，這與毛建等[14]的研究結(jié)果一致。由此筆者推測(cè)，AECOPD組和COPD穩(wěn)定期患者中NLRP3 mRNA表達(dá)量的差異可能與病原微生物感染引發(fā)體內(nèi)炎性反應(yīng)嚴(yán)重程度有關(guān)。

AECOPD重-極重組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量高于輕-中組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AECOPD肺功能重-極重組患者比輕-中組患者多存在反復(fù)長(zhǎng)期住院、免疫功能低下等情況，而呼吸道病原菌的定植及二重感染的發(fā)生可能與患者長(zhǎng)期使用抗生素、免疫功能低下有關(guān)。外源性病原菌可通過(guò)PAMPs刺激淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞，NLRP3炎性反應(yīng)小體被激活，肺部炎性反應(yīng)加重[15-16]。

COPD患者血清中MDA濃度升高，NLRP3 mRNA表達(dá)量升高，MDA濃度與NLRP3 mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。COPD患者血清中SOD濃度降低，NLRP3 mRNA表達(dá)量升高，SOD濃度與NLRP3 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。COPD患者FEV1%下降，NLRP3 mRNA表達(dá)量升高，F(xiàn)EV1% pred與NLRP3 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。機(jī)體遭受各種有害刺激時(shí)體內(nèi)出現(xiàn)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，ROS產(chǎn)生增多，并通過(guò)ROS依賴的信號(hào)通路促進(jìn)NLRP3炎性反應(yīng)小體的聚集及活化，從而對(duì)COPD的疾病進(jìn)程產(chǎn)生影響[17-19]。

綜上所述，機(jī)體遭受各種有害刺激時(shí)，出現(xiàn)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，細(xì)胞內(nèi)ROS活化，ROS依賴的信號(hào)通路促進(jìn)NLRP3炎性反應(yīng)小體的聚集及活化，體內(nèi)炎性反應(yīng)加重，從而加重COPD病情。但本組研究對(duì)象多為中老年患者，且樣本量較小，結(jié)果及結(jié)論可能仍存在一定局限性，而氧化應(yīng)激介導(dǎo)NLRP3炎性反應(yīng)小體活化對(duì)COPD患者肺功能的影響的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。