Snail介導的肺上皮間質轉化在肌成纖維細胞活化中的作用

李思泠 朱鐘慧 李秋月 許春杰 趙 靜 王 炎 田 琳

(首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學系,北京 100069)

肺纖維化是指通過肺組織瘢痕化和肺泡間隔的增厚而損害呼吸氣體交換的多種病癥[1]，是肺組織對毒物、自身免疫以及感染性反應的終末階段[2]。肺纖維化是包括矽肺在內的眾多肺部疾病的最終表現(xiàn)，形成過程復雜，發(fā)生機制尚未完全闡明。成纖維細胞增生在肺纖維化疾病中發(fā)揮重要作用，一般認為，成纖維細胞主要來源于肺內固有的間充質細胞和血液(骨髓源性)，而目前研究[3]顯示,肺泡上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是成纖維細胞的來源之一，對肺纖維化的發(fā)生發(fā)展起重要的推動作用。

EMT被視為上皮細胞失去其上皮表型特征而逐漸獲得間質細胞表型特征的過程。上皮細胞由于緊密連接，具有細胞極性，形態(tài)排列緊密，似鋪路石樣，不容易進行自由移動。相反，間質細胞失去了細胞極性，缺少細胞之間的連接，細胞形態(tài)變成長梭形，易于遷移，同時伴有細胞表型的改變。國外學者[4]和本課題組研究[5-6]都顯示，抑制EMT可以抑制組織器官的纖維化。但Tanjore等[7]發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化小鼠肺內EMT來源的肌成纖維細胞極少，這說明EMT來源的成纖維細胞極少轉化為肌成纖維細胞。EMT是如何參與纖維化過程，是否間接參與了成纖維細胞的活化是本研究擬探討的重點。在EMT過程中，多條信號通路發(fā)揮作用，上調核轉錄因子，促進上皮細胞向間充質細胞轉變，其中，核轉錄因子Snail參與多條重要信號通路的信號轉導過程，能夠介導細胞發(fā)生EMT。本課題組前期研究[6]也顯示，在石英誘導肺泡上皮細胞發(fā)生EMT過程中，Snail的表達上調。Snail介導的EMT如何參與組織纖維化，具體機制并不清楚。近年來，有研究[8]顯示，上皮細胞受到損傷后可以促進成纖維細胞活化為肌成纖維細胞，在基因層面上體現(xiàn)為成纖維細胞的纖維化標志物Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ α1,COL1A1)、Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ α1,COL3A1)和間質標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等基因表達的上調，進而引起纖維化的發(fā)生。

因此，筆者設想，上皮細胞發(fā)生EMT后可以促進肺內肌成纖維細胞活化。肺泡上皮細胞發(fā)生EMT后能否活化肺內固有成纖維細胞從而引起肺纖維化，目前未見報道。本研究通過體外共培養(yǎng)小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞(MLE-12)和小鼠胚肺成纖維細胞(NIH-3T3)并進行相關實驗，擬討論發(fā)生由Snail介導的EMT的上皮細胞能否引起肺內固有成纖維細胞的活化。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑和儀器

小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞株MLE-12(美國ATCC細胞研究中心)，小鼠胚肺成纖維細胞株NIH-3T3(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心),高糖DMEM、胎牛血清(美國HyClone公司)，青鏈霉素混合液、胰酶、全蛋白提取試劑盒KGP2100(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，重組人轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)(美國PeproTech公司)，Snai1-shRNAi、陰性對照病毒(上海吉凱基因科技有限公司)，Transzol up、mRNA反轉錄試劑盒AT301、qPCR試劑盒AQ141(北京全式金生物技術有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，兔多克隆Snail抗體(美國Abgent公司)，兔多克隆GAPDH抗體、羊抗兔二抗抗體(美國CST公司)，酶標儀(美國BioTek技術有限公司)，PCR擴增儀(美國Thermo Hybaid公司)，熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及TGF-β1刺激細胞

1.2.1 細胞分組

對照組：上室加入基礎培養(yǎng)基，下室加入NIH-3T3;TGF-β1組：上室加入基礎培養(yǎng)基和10 ng/mL TGF-β1,下室加入NIH-3T3;MLE-12組：上室加入MLE-12,下室加入NIH-3T3;MLE-12+TGF-β1組：上室MLE-12培養(yǎng)中加入TGF-β1,下室加入NIH-3T3。

1.2.2 試驗方法

小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞(MLE-12)和小鼠胚肺成纖維細胞(NIH-3T3)均在含有10%(體積分數(shù))胎牛血清、1%(質量分數(shù))雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)的基礎培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫[95% 濕度，5%(體積分數(shù))CO2]的細胞培養(yǎng)箱中孵育。

用10 ng/mL的TGF-β1刺激MLE-12 48 h可誘發(fā)EMT。

在共培養(yǎng)體系中，使用上室膜孔隙為0.4 μm的六孔Transwell板，在下室接種NIH-3T3，細胞密度為1×106個/mL，上室接種MLE-12，細胞密度為2×105個/mL。待上下室細胞密度均達到80%開始進行共培養(yǎng)，使用10 ng/mL的TGF-β1刺激上室MLE-12，共培養(yǎng)48 h。

1.3 慢病毒轉染MLE-12細胞

1.3.1 細胞分組

對照組：上室加入空病毒轉染的MLE-12，下室加入NIH-3T3；對照+TGF-β1組：上室空病毒轉染的MLE-12培養(yǎng)中加入TGF-β1,下室加入NIH-3T3；Snail-shRNA組：上室加入Snail-shRNA病毒轉染的MLE-12,下室加入NIH-3T3；Snail-shRNA+TGF-β1組：上室Snail-shRNA病毒轉染的MLE-12培養(yǎng)中加入TGF-β1,下室加入NIH-3T3。

1.3.2 試驗方法

根據(jù)預實驗確定的最佳染毒條件慢病毒轉染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=50對MLE-12進行轉染(陰性對照病毒、Snail-shRNA病毒)，轉染72 h后進行傳代，獲得穩(wěn)定轉染株。

1.4 熒光定量PCR法檢測EMT及纖維化相關基因表達

使用Tranzol up提取細胞總RNA，使用酶標儀測定樣品總RNA濃度及純度，用于對總RNA進行反轉錄以得到cDNA。將cDNA稀釋3倍后，取1 μL作為實時熒光定量PCR的模板，用于PCR擴增。反應條件為：預變性94 ℃，5 s；變性94 ℃，5 s；退火58 ℃，15 s；延伸72 ℃，10 s，共40個循環(huán)數(shù)。每個樣品做3個復孔。上皮標志物E鈣粘蛋白(E-cadherin，CDH1)、間質標志物α-SMA、核轉錄因子Snail、纖維化標志物COL1A1、COL3A1的Ct值經(jīng)內參基因GAPDH標化后，根據(jù)2-ΔΔCt公式計算各樣品相關基因的mRNA 相對表達量。引物序列詳見表1。

表1 mRNA引物序列(小鼠)

1.5 Western blotting檢測Snail蛋白表達

細胞樣品蛋白質的提取按蛋白抽提試劑盒說明書進行，BCA法測定各樣品蛋白質濃度，加入5×SDS蛋白上樣電泳緩沖液，沸水浴10 min，冷卻至室溫。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Snail蛋白質表達。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，兩組以上的均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)及LSD多重比較檢驗分析，統(tǒng)計結果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有實驗均獨立重復3次。

2 結果

2.1 TGF-β1對MLE-12細胞形態(tài)及EMT相關表型的影響

誘導48 h后，光鏡下可見對照組MLE-12細胞狀態(tài)良好，保持了上皮樣形態(tài)；TGF-β1誘導組MLE-12細胞則呈現(xiàn)出紡錘形(圖1)。RT-qPCR結果顯示，TGF-β1誘導48 h后，MLE-12的CDH1 mRNA表達量較對照組降低，而α-SMA以及核轉錄因子Snail mRNA 表達量則升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見圖2。

圖1 TGF-β 1(10 ng/mL)刺激48 h對MLE-12細胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of TGF-β 1 (10 ng/mL) on the morphology of MLE-12 cells stimulated by 48 h(10×) A:before stimulation； B: after stimulation; TGF-β 1：transforming growth factor-β 1.

圖2 TGF-β 1刺激48 h對MLE-12 CDH1、α-SMA、Snail mRNA表達的影響Fig.2 Effect of TGF-β 1 on the expression of CDH1, α-SMA, Snail mRNA of MLE-12 cells stimulated by 48 h TGF-β 1：transforming growth factor-β 1; CDH1：E-cadherin； α-SMA：α-smooth muscle actin; *P<0.05, ** P<0.01 vs control; n=3.

圖3 上室不同條件共培養(yǎng)48 h對NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達的影響Fig.3 Effects of 48 h of co-culture on the expression of α-SMA, COL1A1 and COL3A1 mRNA of NIH-3T3 in different conditions of insert*P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05， ##P<0.01 vs MLE-12; &&P<0.01 vs TGF-β 1; n=3； TGF-β 1:transforming growth factor-β 1;α-SMA:α-smooth muscle actin:COL1A1：collagen Ⅰ α1; COL3A1：collagen Ⅲ α1.

2.2 發(fā)生EMT的MLE-12能夠促進NIH-3T3的活化

與空白對照相比，TGF-β 1與MLE-12都可引起下室NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達的上調。經(jīng)由TGF-β 1誘導的MLE-12引起下室NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達的上調程度分別高于TGF-β 1和MLE-12的單獨作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖3。

2.3 敲減MLE-12的Snail基因能夠抑制共培養(yǎng)體系NIH-3T3的活化

慢病毒處理MLE-12后，相對于空病毒對照組，Snail-shRNA慢病毒可明顯降低MLE-12的Snail mRNA和蛋白質表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖4、圖5。

圖4 慢病毒轉染后MLE-12 Snail mRNA表達Fig.4 Expression of Snail mRNA of MLE-12 cells after lentivirus transfection ** P<0.01 vs control; n=3.

與對照組相比，TGF-β 1可引起下室NIH-3T3 成纖維標志物α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達的上調，相比于Snail-shRNA-MLE-12，由TGF-β 1誘導的Snail-shRNA-MLE-12同樣可引起下室NIH-3T3 成纖維標志物α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達的上調。但相對于對照+TGF-β 1組，由TGF-β 1誘導的Snail-shRNA-MLE-12可下調下室NIH-3T3的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖6。

圖5 慢病毒轉染后MLE-12 Snail 蛋白表達Fig.5 Expression of Snail protein of MLE-12 cells after lentivirus transfection ** P<0.01 vs control; n=3.

圖6 上室不同條件共培養(yǎng)48 h對NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達影響Fig.6 Effects of 48 h of co-culture on the expression of α-SMA, COL1A1 and COL3A1 mRNA of NIH-3T3 in different conditions of insert *P<0.05, **P<0.01 vs control;##P<0.01 vs Snail-shRNA,&P<0.05,&&P<0.01 vs control+TGF-β 1;n=3;TGF-β 1:transforming growth factor-β 1; α-SMA: α-smooth muscle actin; COL1A1：collagen Ⅰ α1； COL3A1：collagen Ⅲ α1.

3 討論

肺纖維化是多種肺部疾病的最終表現(xiàn)結果，一般指多種原因導致肺組織損傷后的病理過程，早期表現(xiàn)為彌漫性肺炎，后期為成纖維細胞增生和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積[9]。臨床表現(xiàn)為進行性呼吸困難并伴刺激性干咳，且隨著病情進展，患者呼吸功能不斷惡化，最終演變?yōu)楹粑ソ呱踔了劳鯷10]。肺纖維化可由各種急性和慢性肺損傷引發(fā)[11]，是一種復雜的肺間質疾病，基因異常、自身免疫、職業(yè)暴露、創(chuàng)傷、藥物及病原微生物感染等多種因素均可引起肺纖維化的發(fā)生。例如，矽肺就是石英粉塵的職業(yè)暴露引起的肺部彌漫性纖維化為主的全身性疾病，是我國目前常見的且危害較為嚴重的職業(yè)病，已經(jīng)成為我國亟待解決的公共衛(wèi)生問題。不論是何種病因，肺纖維化在細胞水平上都體現(xiàn)為一些持續(xù)或反復損傷的修復反應，或對于刺激的異常調節(jié)以及不恰當?shù)男迯蚚12]。由于發(fā)病機制不明，目前臨床上缺乏療效顯著的治療藥物[13]。探索肺纖維化的發(fā)病機制以延緩或阻斷其發(fā)生發(fā)展的策略，具有重要的實際意義。

在肺纖維化疾病中，成纖維細胞的增生發(fā)揮重要作用。近年來有研究[3]顯示EMT是成纖維細胞的主要來源之一，并且對纖維化的發(fā)生發(fā)展起重要推動作用。Iwano等[14]在腎臟纖維化的腎間質中發(fā)現(xiàn)了成纖維細胞活化標志物成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein1,FSP1)、波形蛋白、α-SMA的高表達，在腎纖維化發(fā)生期間，F(xiàn)SP1表達陽性的成纖維細胞也通過局部EMT大量出現(xiàn)，證明了上皮細胞可以通過EMT導致成纖維細胞的活化和纖維化發(fā)生。Zeisberg等[15]通過譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化病灶內，大量的成纖維細胞來源于發(fā)生EMT的上皮細胞。Kim等[3]在特發(fā)性肺纖維化患者的肺上皮細胞中同時發(fā)現(xiàn)了上皮和間質標志物的表達，并通過轉基因小鼠證實發(fā)生EMT的肺泡上皮細胞是纖維化病灶中間質細胞的主要來源之一。在EMT過程中，多條信號通路發(fā)揮作用，上調轉錄因子，促上皮細胞向間充質轉變，其中，核轉錄因子Snail參與包括TGF-β通路在內的多條信號通路的信號轉導過程，能夠誘導上皮細胞發(fā)生EMT，在肌成纖維細胞活化過程中起到重要作用。TGF-β是一種促分泌的蛋白，能夠影響細胞的自分泌及旁分泌。TGF-β主要包括3種類型，即TGF-β 1、TGF-β2和TGF-β3，其中，TGF-β 1在包括腫瘤和纖維化等病理過程的發(fā)生發(fā)展中都起到重要的調節(jié)作用。TGF-β 1在所有哺乳動物的細胞中都有表達，是誘導EMT的重要細胞因子。在一些體外培養(yǎng)的上皮細胞中，單純使用TGF-β 1刺激就可以誘導EMT的發(fā)生[16]。TGF-β 1在肺纖維化疾病中是一個重要的促纖維化因子，在矽肺中，石英刺激巨噬細胞后主要通過分泌TGF-β 1，作用于包括肺泡上皮細胞在內的特異的靶細胞，促進肺泡上皮細胞發(fā)生EMT，成纖維細胞增生和膠原合成并活化為肌成纖維細胞，分泌膠原蛋白，最終引起肺纖維化[17]。因此在本研究中，使用TGF-β 1的刺激建立肺上皮細胞發(fā)生EMT模型。結果顯示，使用TGF-β 1刺激MLE-12 48 h后，與對照組相比，MLE-12在形態(tài)學上由鋪路石樣形態(tài)變?yōu)榧忓N形，呈現(xiàn)間質樣變化；在基因表達方面，與對照組相比，上皮標志物CDH1表達下調，α-SMA表達上調，并且Snail基因表達顯著升高，這表明TGF-β 1能夠誘導MLE-12發(fā)生EMT。

國外學者[4]和本課題組的前期研究[5-6]都顯示抑制EMT與抑制組織器官纖維化關系密切。本課題組在前期研究[5-6]顯示， 骨形態(tài)發(fā)生蛋白7可以抑制大鼠矽肺模型中的肺纖維化，這可能與肺組織中EMT的抑制有關。然而，有學者[7]發(fā)現(xiàn)，EMT來源的成纖維細胞極少活化為肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞在細胞外基質合成以及纖維化疾病發(fā)生中起關鍵作用，這提示EMT可能不是通過直接轉化為成纖維細胞在纖維化疾病中發(fā)揮作用。EMT究竟如何參與纖維化的發(fā)生已成為近年來的研究熱點，Richeldi等[8]發(fā)現(xiàn)，上皮細胞受到刺激后，可以通過旁分泌的方式促進成纖維細胞的活化，進而引起纖維化的發(fā)生。本課題組結合前期研究以及國內外相關研究[8]，認為旁分泌可能在纖維化發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，因此，通過在體外建立上皮-間質細胞共培養(yǎng)體系，模擬旁分泌模型，擬探討上皮細胞能否通過旁分泌的方式引起成纖維細胞活化為肌成纖維細胞。本研究通過建立MLE-12與NIH-3T3共培養(yǎng)體系，模擬體內環(huán)境的相互作用，探討上皮細胞發(fā)生EMT能否活化成纖維細胞進而引起纖維化的發(fā)生。本研究表明，在MLE-12與NIH-3T3共培養(yǎng)體系中，發(fā)生EMT的MLE-12能顯著誘導NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達的上調。該研究結果提示發(fā)生EMT的上皮細胞能夠引起成纖維細胞活化為肌成纖維細胞。但發(fā)生EMT的上皮細胞具體通過旁分泌哪種細胞因子發(fā)揮作用，還有待繼續(xù)研究。

Lovisa等[18]發(fā)現(xiàn)，在腎纖維化小鼠模型中，纖維化病灶內的腎小管上皮細胞中Snail表達量豐富，對腎小管上皮細胞Snail基因進行敲除后，腎小管上皮細胞EMT被抑制，腎纖維化減輕。本課題組的前期研究[19]也顯示在石英誘導肺上皮細胞發(fā)生EMT的過程中，Snail表達上調。Snail是轉錄抑制因子中的一員，是連接多個信號通路的中心分子，如核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路和TGF-β信號通路等，并且已被證實可以抑制上皮標志物CDH1的表達[20-21]。抑制上皮細胞的Snail能否抑制成纖維細胞活化為肌成纖維細胞，是本研究的研究重點。在本研究中，對MLE-12分別使用Snail慢病毒和陰性對照病毒進行轉染，使用轉染后的MLE-12與NIH-3T3建立共培養(yǎng)體系，并用TGF-β 1對MLE-12進行刺激，結果表明，與TGF-β 1+陰性對照病毒組相比，TGF-β 1+Snail慢病毒轉染組下室NIH-3T3 的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達上調程度降低。該結果提示，抑制上皮細胞Snail基因的表達可以抑制其對成纖維細胞的活化作用。

本研究證實了Snail介導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞發(fā)生EMT可引起成纖維細胞的活化，敲減Ⅱ型肺泡上皮細胞的Snail基因可以抑制成纖維細胞活化為肌成纖維細胞。 提示Snail介導的肺上皮間質轉化在肌成纖維細胞活化中發(fā)揮重要作用。