HT22細胞系鐵死亡敏感性研究

楊田麗 楊勇飛 袁增強

(1.首都醫(yī)科大學(xué)腦重大疾病研究中心,北京 100069; 2.北京腦重大疾病研究院,北京 100069; 3. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院,北京 100081; 4.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所,北京 100850)

鐵死亡是一種Fe2+依賴的氧化性非凋亡性程序性死亡[1]，首次發(fā)現(xiàn)于RAS(small G-protein)突變的癌細胞中[2-3]，其后在神經(jīng)元、腎小管細胞、T細胞、成纖維細胞中均觀察到鐵死亡現(xiàn)象[4-7]。

細胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧(reactive oxygen species,ROS)由穩(wěn)定的含F(xiàn)e2+酶催化生成[1]，由抗氧化系統(tǒng)清除，從而在生理狀態(tài)下保持穩(wěn)態(tài)[8]。鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin抑制細胞膜上的谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運體，進入細胞的胱氨酸減少，胞內(nèi)還原型谷胱甘肽合成減少[1]，谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的功能降低[6]，脂質(zhì)ROS清除減少，細胞內(nèi)脂質(zhì)ROS蓄積，誘導(dǎo)鐵死亡，鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3直接抑制GPX4，胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平增加，導(dǎo)致鐵死亡[9]。細胞發(fā)生鐵死亡時，關(guān)鍵因子SLC7A11或PTGS2 mRNA表達增加，可作為鐵死亡的標(biāo)志物[1，3]。鐵離子螯合劑如去鐵胺(deferoxamine)或抗氧化劑(ferrostatin-1，F(xiàn)er-1)可以抑制鐵死亡的發(fā)生[1]。

HT22是小鼠海馬神經(jīng)元細胞系[10-12]，廣泛應(yīng)用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。本研究選用Erastin或RSL3處理HT22細胞系，探究HT22細胞系是否對這兩種鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感，為使用HT22細胞系研究神經(jīng)退行性疾病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中神經(jīng)元鐵死亡的作用和機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Erastin、RSL3、Ferrostatin-1購自美國Selleckchem公司，DMSO購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自浙江杭州四季青生物工程材料有限公司；鏈霉素-盤尼西林試劑購自上海碧云天公司；CCK-8試劑盒和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司；Tris粉末、NaCl粉末、EDTA粉末、Triton X-100、濃鹽酸、硫脲、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團；三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、硫代巴比士酸(thiobarbituric acid，TBA)、菲羅嗪購自美國Sigma公司；Trizol購自美國Ambion公司，RT-qPCR試劑盒購自北京康為公司。

1.2 Erastin或RSL3處理細胞

將鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin或RSL3粉末溶于DMSO，分別配置成10 mmol/L、2 mmol/L的儲備液，使用時終濃度為10 μmol/L、2 μmol/L，以DMSO作為溶質(zhì)對照。Ferrostatin-1配置成2 mmol/L的儲備液，使用時終濃度為2 μmol/L。將細胞分為3組，分別使用DMSO、Erastin或RSL3、Erastin+Ferrostatin-1或RSL3+Ferrostatin-1處理細胞，藥物處理6 h后檢測細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化和Fe2+濃度及相關(guān)基因mRNA表達，24 h后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并檢測細胞活力。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

收集處理后細胞離心，用1 mL細胞培養(yǎng)基來重懸細胞，加入100 μL/孔細胞懸液，加入10 μL的CCK-8溶液，于細胞培養(yǎng)箱孵育1～4 h，利用酶標(biāo)儀于412 nm處檢測各孔吸收光。

1.4 丙二醛法檢測脂質(zhì)過氧化水平

收集處理后細胞離心，PBS洗兩次，加入300 μL裂解液，4 ℃裂解1 h后，4 ℃、13 000 r/min離心10 min。在200 μL上清中加入600 μL的0.67%(體積分?jǐn)?shù))TBA溶液[TBA溶于20%(體積分?jǐn)?shù))TCA溶液中]，95 ℃水浴鍋孵育60 min?；謴?fù)至室溫后，4 000g離心10 min，532 nm處檢測吸收光，測定脂質(zhì)過氧化物的含量。

裂解液：20 mmol/L Tris-HCl pH值為7.5; 150 mmol/L NaCl; 2%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100; 1 mmol/L EDTA。

1.5 菲羅嗪法檢測Fe2+濃度

收集處理后細胞離心，PBS洗兩次，加入300 μL裂解液，4 ℃裂解1 h后，4 ℃、13 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移200 μL上清到96孔板，50 μL/孔。加入50 μL/孔的0.1 mol/L鹽酸，混勻，25 ℃孵育30 min。每孔加入100 μL 鐵探針，混勻，25 ℃避光孵育60 min。562 nm檢測吸光度值，測定Fe2+的含量。

裂解液：20 mmol/L Tris-HCl pH值為7.5; 150 mmol/L NaCl; 2%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100; 1 mmol/L EDTA；鐵探針：525 mg菲羅嗪和15 g硫脲溶于1 L的4 mol/L醋酸鈉溶液。

1.6 定量RT-PCR檢測基因mRNA表達

加入500 μL/孔 Trizol提取細胞總RNA，微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度。用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用定量RT-PCR試劑盒按照說明書檢測細胞SLC7A11、PTGS2的mRNA表達。所用PCR引物如下：mSLC7A11-realtime-F:5′-GGCACCGTCATCGGATCAG-3;R:5′-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3。mβ-actin-realtime-F:5′- GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3;R:5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3；mPTGS2- realtime-F:5′-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3；R:5-GCACGTAGTCTTCGATCA-CTATC-3。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Erastin或RSL3 誘導(dǎo)HT22鐵死亡

Erastin或RSL3處理 HT22細胞24 h后，顯微鏡下觀察細胞的存活情況，并檢測不同處理后的細胞活力。Erastin或RSL3處理HT22后，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞發(fā)生明顯死亡，加入鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1后，細胞死亡顯著減少(圖1A，C)。細胞活力CCK-8法檢測結(jié)果顯示Erastin或RSL3處理組相較于對照組細胞活力降低，加入Ferrostatin-1后得到恢復(fù)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1B，D)。

圖1 Erastin或RSL3誘導(dǎo)HT22鐵死亡Fig.1 Erastin or RSL3 induces ferroptosis in HT22A: morphology of HT22 treated with Erastin; B: relative cell viability of HT22 treated with Erastin decrease, Fer-1 partly rescue the cell death，***P<0.01; C: morphology of HT22 treated with RSL3;D: relative cell viability of HT22 treated with RSL3 decrease, Fer-1 partly rescue the cell death,***P<0.01.

2.2 Erastin或RSL3處理HT22后胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物水平增加

處理HT22細胞6 h后，使用丙二醛法檢測細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物水平，Erastin或RSL3處理HT22后，細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物水平增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 Erastin或RSL3處理后脂質(zhì)過氧化物水平Fig.2 Lipid peroxidation in HT22 after treated by Erastin or RSL3 A: RSL3;B: Erastin;***P<0.001

2.3 Erastin或RSL3處理HT22后胞內(nèi)Fe2+濃度變化

處理HT22細胞6 h后，使用菲羅嗪法檢測胞內(nèi)Fe2+濃度。細胞內(nèi)的Fe2+濃度與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 Erastin或RSL3處理后Fe2+濃度Fig.3 Fe2+ concentration in HT22 cells after treated by RSL3 or Erastin A: RSL3;B: Erastin.

2.4 Erastin或RSL3處理HT22后SLC7A11、PTGS2mRNA表達

處理HT22細胞6 h后，使用定量RT-PCR法檢測SLC7A11、PTGS2 mRNA表達。細胞SLC7A11、PTGS2mRNA表達增加，與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 Erastin或RSL3處理后細胞SLC7A11、PTGS2 mRNA表達Fig.4 Expression of SLC7A11, PTGS2 mRNA after treated by Erastin or RSL3A: SLC7A11 mRNA after treated by Erastin; B: PTGS2 mRNA after treated by Erastin; C: SLC7A11 mRNA after treated by RSL3;D: PTGS2 mRNA after treated by RSL3. **P<0.01， ***P<0.001.

3 討論

鐵死亡作為一種新的程序性細胞死亡方式，在生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)等方面與其他細胞死亡方式(凋亡、壞死、自噬)有明顯差別。鐵死亡主要表現(xiàn)為線粒體變小，線粒體膜密度增加，線粒體內(nèi)膜上嵴減少甚至消失，線粒體外膜破裂，細胞核無改變，沒有染色體濃縮，細胞膜也沒有出泡、破裂，鐵離子螯合劑、抗氧化劑等可以抑制鐵死亡[1]。

研究[6]顯示鐵死亡與多種疾病有關(guān)，例如腎細胞癌、淋巴瘤等癌癥、急性腎衰竭、急性肝損傷等。而且在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程中發(fā)現(xiàn)鐵死亡現(xiàn)象，如卒中、阿爾茲海默病、帕金森病、亨廷頓病[13]，加入鐵死亡抑制劑可以改善疾病的癥狀及預(yù)后[14-16]。研究不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程中鐵死亡的發(fā)生及機制可能為疾病治療提供新思路。

為闡明神經(jīng)疾病過程中神經(jīng)元鐵死亡的機制，研究需要細胞模型作支持。原代神經(jīng)元因獲得數(shù)量少、培養(yǎng)時間長等原因在分子機制研究中應(yīng)用受限，而神經(jīng)元細胞系是良好選擇。本課題主要使用CCK-8法、丙二醛法、菲羅嗪法和RT-PCR法來檢測HT22小鼠海馬神經(jīng)元細胞系是否適合研究鐵死亡。鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin或RSL3處理HT22后，F(xiàn)e2+濃度無明顯變化；細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物水平增加；顯微鏡下觀察到明顯的細胞死亡，細胞活力減弱，HT22發(fā)生鐵死亡。以上結(jié)果提示Erastin或RSL3主要抑制脂質(zhì)過氧化物的清除，而不影響脂質(zhì)過氧化物的生成，導(dǎo)致其在細胞內(nèi)的蓄積，進而誘導(dǎo)HT22鐵死亡。Erastin或RSL3處理HT22后，細胞SLC7A11、PTGS2mRNA水平增加，從分子水平上提示了鐵死亡的發(fā)生。本研究證明HT22是鐵死亡敏感的細胞系，可作為細胞模型來探究相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中鐵死亡的發(fā)生機制，為篩選疾病治療的新靶點提供理論依據(jù)。