KCNH6基因肝臟特異性敲除小鼠的構(gòu)建及其初步應(yīng)用

盧 晶 李 奇 朱曉蓉 謝榮榮 楊金奎

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科 糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實驗室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

現(xiàn)代社會，隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高和生活習(xí)慣的改變，飲食結(jié)構(gòu)與以往存在很大差異，全球糖尿病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前，我國糖尿病發(fā)病率居世界首位[1]。

胰腺由外分泌腺和內(nèi)分泌腺兩部分組成。胰腺內(nèi)分泌腺又稱胰島。胰島主要包括α、β、δ和PP細(xì)胞4種細(xì)胞。胰島細(xì)胞可以分泌特異性的胰腺激素從而調(diào)節(jié)機(jī)體的血糖濃度。胰島細(xì)胞數(shù)量減少，胰島正常結(jié)構(gòu)破壞，會導(dǎo)致機(jī)體糖耐量異常乃至糖尿病。傳統(tǒng)途徑中，ATP敏感性鉀通道[ATP-sensitive K+(KATP) channel]主要調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞在葡萄糖刺激下的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)。而電壓門控依賴性ERG鉀通道[voltage-gated eag-related gene (Erg) K+channels]家族也在胰島細(xì)胞中高表達(dá)。ERG家族屬于電壓依賴性鉀通道[voltage dependent K+(Kv) channels]，包括KCNH2編碼的ERG1通道，KCNH6基因編碼的ERG2通道以及KCNH7編碼的ERG3。KCNH2突變的患者患有2型長QT間期綜合征(long-QT syndrome)且胰島素分泌濃度升高[2]。

糖尿病多重病理生理過程被描述為“惡兆八重奏” (ominous octet)[3]:①胰島β細(xì)胞胰島素分泌缺陷;②肌肉組織葡萄糖攝取減少;③肝糖輸出增加;④“腸促胰島素效應(yīng)”減弱;⑤胰高血糖素濃度升高;⑥腎臟對葡萄糖的處理失調(diào);⑦神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂;⑧脂代謝紊亂。脂代謝紊亂主要表現(xiàn)為總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)的升高，常伴有高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)的降低。糖尿病合并脂代謝紊亂貫穿于糖尿病胰島素抵抗、血糖調(diào)節(jié)異常及糖尿病發(fā)生、發(fā)展的始末。糖尿病患者存在的糖脂代謝異常是引起血管神經(jīng)組織病變，進(jìn)而導(dǎo)致大血管及微血管合并癥的重要原因，也是糖尿病致死率增高的主要原因[4]。

本課題組[5]的前期工作中，發(fā)現(xiàn)1個KCNH6鉀通道雜合突變的糖尿病家系，家系中成年患者表現(xiàn)為低胰島素血癥和糖尿病，且KCNH6在葡萄糖刺激的胰島素分泌中發(fā)揮重要作用，課題組前期采用TALEN技術(shù)成功構(gòu)建了KCNH6基因全身性敲除小鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠存在糖耐量異常。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，6基因敲除小鼠存在血脂代謝異常，其作用機(jī)制與AMPK參與的脂肪酸氧化有關(guān)。上述研究都是在KCNH6基因全身性敲除的基礎(chǔ)上完成。為了更精確的研究KCNH6基因?qū)Ω闻K脂代謝的影響，本研究將采用Cas9技術(shù)構(gòu)建KCNH6基因條件性敲除(conditional knockout，CKO)動物模型，并將其與肝臟特異性Cre小鼠(Alb-cre)雜交，最終得到KCNH6肝臟特異性敲除小鼠，探討KCNH6基因?qū)Ω闻K血脂代謝的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康的雄性C57BL/6J小鼠，8周齡，購于南京大學(xué)，實驗動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。實驗時，雄性KCNH6敲除小鼠(KCNH6 knockout，KCNH6 KO)與野生對照小鼠(wild-type，WT)均為20周齡。飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為20～24 ℃、環(huán)境濕度為50%～70%的SPF級動物房內(nèi)，正常日光周期，自由進(jìn)食及飲水，保持墊料干燥。

1.2 采用Cas9技術(shù)構(gòu)建條件性敲除小鼠

在小鼠KCNH6基因的非編碼區(qū)中選擇內(nèi)含子2、3間和內(nèi)含子4、5之間分別設(shè)計Cas9插入同向的LoxP序列，并在LoxP序列兩端攜帶相應(yīng)的同源序列，構(gòu)建出兩段“同源序列-LoxP-同源序列”的DNA片段作為打靶載體，設(shè)計策略見圖1。5′端Cas9序列為5′-TAGGTAAAGCTGCTGTCCAAGCGGG-3′；3′端Cas9序列為5′-TGTCTCTAGCTGCTAACTTTGG-3′。

圖1 Cas9設(shè)計策略Fig.1 Design strategy of Cas9UTR: untranslated regions

1.3 KCNH6基因條件性敲除小鼠構(gòu)建

將純化后的打靶載體通過顯微注射的方法注入小鼠胚胎干細(xì)胞中，得到攜帶LoxP突變基因的靶細(xì)胞。將中靶細(xì)胞注入小鼠囊胚中內(nèi)，將囊胚植入假孕小鼠子宮，發(fā)育得到F0代LoxP突變基因的嵌合體小鼠。

將嵌合體小鼠與野生型C57/B6小鼠進(jìn)行繁育，得到F1代小鼠。通過基因型鑒定篩選出F1代雜合子，并用其作為親本。交配繁育F2代，得到的F2代再進(jìn)行基因鑒定，最終得到兩條染色體均帶有LoxP突變基因的純合突變小鼠(Flox小鼠)，從而建立突變?nèi)后w。

下列反應(yīng)物構(gòu)成20 μL的反應(yīng)體系：模板DNA 2.0 μL，緩沖液 (含Mg2+) 2.0 μL，dNTP混合物(10 mmol/L) 0.5 μL，引物混合液 (10 mol/L) 0.5 μL， DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，超純水14.5 μL。進(jìn)行降落PCR，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃5 min。變性98 ℃30 s；退火65 ℃30 s；延伸72 ℃ 45 s；共20個循環(huán)；再變性98 ℃30 s；退火55 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 45 s；共20個循環(huán)。最后再延伸70 ℃10 min。PCR之后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。鑒定正向引物：5′-CCCCATCTGCTAAGCCTTAATTAC-3′；反向引物:5′-GAAGGCTGGAGGCTGCAAACC-3′。

1.4 KCNH6基因肝臟細(xì)胞特異性敲除小鼠基因型的鑒定

由于Flox鼠的目的基因片段上下游均插入了同向的LoxP片段，將其與CreT小鼠進(jìn)行雜交后，即能在特異性表達(dá)Cre重組酶的組織中將兩段LoxP序列之間的基因刪除，同時生成一個終止子，以達(dá)到條件性敲除目的基因的作用。剪取小鼠尾尖消化后，使用酚/氯仿法抽提基因組DNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)鑒定小鼠基因型。

構(gòu)建PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃5 min；變性95 ℃30 s；退火58 ℃30 s；延伸72 ℃30 s；共40個循環(huán)，最后再延伸70 ℃10 min。PCR之后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。根據(jù)電泳結(jié)果篩選含有目的條帶的小鼠，判斷對應(yīng)小鼠是雜合子還是純合子,引物序列見表1。

1.5 一般情況和血脂測定

小鼠自離乳后開始監(jiān)測體質(zhì)量和進(jìn)食量。10周和20周禁食12 h后內(nèi)眥取血，監(jiān)測體質(zhì)量、進(jìn)食量和血液生物化學(xué)相關(guān)指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Prism5 (GraphPad Software) 進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的Mann-WhitneyU檢驗。體質(zhì)量監(jiān)測采用雙因素重復(fù)測量的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物序列

F:forward;R:reverse.

2 結(jié)果

2.1 KCNH6條件性敲除小鼠鑒定

將F0代Flox小鼠與野生型C57/B6小鼠進(jìn)行繁育，得到F1代小鼠。剪尾提取基因組后，采用降落PCR擴(kuò)增的方法檢測Flox片段。理論上，不含F(xiàn)lox片段的小鼠可見1條307 bp條帶，F(xiàn)lox純合子只有1條400 bp條帶，雜合子有307 bp和400 bp 2條帶。63和69為野生型，64、65、66、67為Flox雜合子小鼠(圖2)。

圖2 KCNH6條件性敲除小鼠鑒定電泳圖Fig.2 Electrophoretic pattern of KCNH6 conditioned knockout mice identification63-69: mouse; TRANS 2K: marker.TRANS 2K plus II marker (bp): 8 000，5 000，3 000，2 000，1 000，750，500，250，100； 500 bp is highlight; P: positive control; B6: C57/B6; N: negative control.

2.2 KCNH6肝臟細(xì)胞特異性敲除小鼠鑒定

將Flox純合子小鼠(基因型為KCNH6flox/wt)與CreT小鼠進(jìn)行雜交，得到表達(dá)Cre重組酶的Flox雜合鼠(基因型為KCNH6flox/wtCreT)和不表達(dá)Cre的Flox雜合鼠(基因型為KCNH6flox/wtCreW)。采用KCNH6flox/wtCreT進(jìn)行內(nèi)交，可得到表達(dá)Cre的Flox純合鼠，基因型為KCNH6flox/floxCreT；或不表達(dá)Cre的小鼠，基因型為KCNH6flox/floxCreW。

采用鼠尾消化后提取DNA，PCR擴(kuò)增檢測Flox和Cre的表達(dá)。表達(dá)Flox片段的小鼠可在400 bp見條帶(圖3A)，表達(dá)Crew重組酶的鼠在351 bp處可見條帶(圖3B)，表達(dá)CreT重組酶的鼠在390 bp處可見條帶(圖3C)。成功構(gòu)建出KCNH6基因肝臟細(xì)胞敲除鼠(基因型為KCNH6flox/floxCreT)及其對照鼠(基因型為KCNH6flox/floxCreW)。280為KCNH6flox/floxCreT(以下簡稱為KO鼠)。278、279、281、282為KCNH6flox/floxCreW(以下簡稱為WT鼠)。

2.3 KCNH6肝臟細(xì)胞特異性敲除小鼠一般情況監(jiān)測

經(jīng)過大量繁殖后，得到大量KO和WT小鼠。選取雄鼠和雌鼠，監(jiān)測小鼠體質(zhì)量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖3 KCNH6肝臟細(xì)胞特異性敲除小鼠鑒定圖Fig.3 Electrophoretic pattern of KCNH6 hepatic knockout mice identificationA:left: Flox is 400 bp; right: LoxP is 514 bp; B:CreW is 351 bp;C:CreT is 390 bp; P: positive control; B6: C57/B6; N: negative control; DL2000: marker. DL2000 marker: 2 000，1 000，750，500，250，100 bp. 750 bp is highlight.

圖4 體質(zhì)量曲線監(jiān)測Fig.4 Detection of body weightA:male, WT:n=6,KO: n=9; B:female, WT:n=7,KO: n=8;WT: wild-type; KO: knockout.

2.4 KCNH6肝臟細(xì)胞特異性敲除小鼠脂代謝

選取雌鼠和雄鼠KO，同窩對照為WT小鼠。分別在8周和20周禁食后內(nèi)眥取血，測血清中總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇。8周的雄鼠血脂4項差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，KO雌鼠的總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖5)。20周時，KO雄鼠總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇均明顯高于WT組(P<0.05，圖6)。

圖5 8周KO和WT小鼠血脂4項檢測結(jié)果Fig.5 Results of lipid metabolism in mice of 8-week-old A: male, WT: n=6, KO: n=9; B: female, WT: n=7, KO: n=8;TC: total cholesterol;TG: triglycerides;HDL-C: high density lipoprotein-cholesterol; LDL-C: low density lipoprotein-cholesterol；WT: wild-type; KO: knockout.

圖6 20周小鼠血脂4項檢測結(jié)果 Fig.6 Results of lipid metabolism in mice of 20-week-old A:male, WT: n=6, KO: n=9,*P<0.05，**P<0.01; B:female, WT: n=7,KO: n=8; TC: total cholesterol;TG:triglycerides;HDL-C: high density lipoprotein-cholesterol; LDL-C: low density lipoprotein-cholesterol；WT: wild-type; KO: knockout.

3 討論

本研究采用Cas9技術(shù)構(gòu)建了KCNH6條件性敲除小鼠，并將其與肝臟細(xì)胞特異性Cre (Alb-cre) 小鼠雜交，最終得到KCNH6基因肝臟細(xì)胞特異性敲除小鼠。以同窩對照為陰性對照，監(jiān)測兩組小鼠的一般狀況發(fā)現(xiàn)其體質(zhì)量和進(jìn)食量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。成年雄性小鼠的膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白較對照組均有明顯升高，提示模型小鼠存在肝臟血脂代謝異常。

經(jīng)典的基因敲除有時候會因為某些基因?qū)ε咛グl(fā)育有影響而無法正常分娩，或者不能產(chǎn)生后代而不能獲得純合子動物模型。而條件性基因敲除技術(shù)可以在特定的組織內(nèi)敲除某個基因，從而避免這一問題，并且有更高的特異性，更有助于研究基因在特異性組織的作用。目前應(yīng)用最為廣泛的是基于Cre/LoxP系統(tǒng)構(gòu)建條件性基因敲除小鼠[6]。Cre重組酶由大腸桿菌F1噬菌體中Cre基因編碼，是由343個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，它可以特異性識別DNA上的LoxP序列，后續(xù)介導(dǎo)不同的特異性重組反應(yīng)[7]。傳統(tǒng)的條件性基因敲除技術(shù)，采用ES細(xì)胞技術(shù)先構(gòu)建條件性敲除小鼠，該技術(shù)穩(wěn)定性高、特異性好，但實驗步驟繁瑣、周期較長等。Le等[8]利用RNA引導(dǎo)Cas9核酸酶技術(shù)可以在多種細(xì)胞中特定的基因組位點(diǎn)進(jìn)行切割、修飾，這一技術(shù)隨即被運(yùn)用到構(gòu)建基因敲除動物模型中。Cas9技術(shù)具有靶向精確性高，實驗周期短，成本低和無物種限制等優(yōu)點(diǎn)，在動物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景十分廣闊。本研究采用Cas9技術(shù)構(gòu)建了KCNH6基因條件性敲除小鼠，用時僅半年。后期與肝臟細(xì)胞特異性Cre小鼠雜交1年后，得到大量KCNH6肝臟細(xì)胞特異性敲除小鼠。

肝臟組織、脂肪組織和肌肉組織是參與機(jī)體能量代謝的重要組織器官。其中，肝臟作為機(jī)體的主要代謝器官，是體內(nèi)碳水化合物和脂質(zhì)生物合成的主要場所，在調(diào)節(jié)機(jī)體的糖脂調(diào)節(jié)中起著重要的作用。機(jī)體中糖代謝與脂代謝有密不可分的關(guān)系，一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化。非酒精性脂肪肝(non-alcohol fatty liver disease，NAFLD)、高三酰甘油血癥、血脂增高等脂代謝紊亂癥狀在代謝綜合征、肥胖和2型糖尿病患者中普遍存在。在胰島素抵抗時，肝臟糖代謝發(fā)生紊亂，后者又加重胰島素抵抗；細(xì)胞中的脂肪酸大量堆積可以導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而引發(fā)糖耐量異常，形成惡性循環(huán)。NAFLD可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)和進(jìn)行性肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌[9]。過量的脂質(zhì)不僅在肝臟內(nèi)積聚，還會在胰腺外周積聚，導(dǎo)致非酒精性脂肪性胰腺疾病(non-alcoholic fatty pancreas disease，NAFPD)。研究[10-11]顯示，NAFPD促進(jìn)胰島素抵抗和糖尿病。長期增加循環(huán)血液中的游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)可導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)毒性，并導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，增加基礎(chǔ)胰島素釋放和葡萄糖刺激的胰島素分泌紊亂。目前對于KCNH6在肝臟中的作用及其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究成果構(gòu)建了KCNH6肝臟細(xì)胞特異性敲除小鼠，并且發(fā)現(xiàn)成年雄鼠存在較明顯的血脂代謝紊亂。模型小鼠的構(gòu)建，將有助于明確KCNH6在肝臟血脂代謝中的具體作用機(jī)制。

建立在動物模型構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，本研究擬通過高脂誘導(dǎo)喂養(yǎng)雄性小鼠，看能否有更明顯的脂代謝異常表型。進(jìn)一步通過分子表達(dá)譜測序，蛋白印記和定量PCR等方法尋找相關(guān)信號通路，明確KCNH6在肝臟脂代謝中的作用及其相關(guān)機(jī)制。