基于SCoT標記的獼猴桃種質資源遺傳多樣性研究

周遇巧，郭國業(yè)，周 索，杜 戈，李書林

(1.南陽師范學院 生命科學與技術學院，河南 南陽 473061；2.河南省西峽獼猴桃研究所，河南 西峽 474573)

獼猴桃原產中國，是屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)的多年生藤本植物[1]。全世界現(xiàn)有約66種獼猴桃屬植物、118個分類單位(變種、變型)[1]，最新的分類系統(tǒng)研究將其劃分為54種、21個變種，共75個分類群[2-3]。研究表明，獼猴桃多數(shù)產于中國，中國被認為是獼猴桃屬植物的起源、進化和分布中心，獼猴桃集中分布于秦嶺以南、橫斷山以東的地域[3-4]。豐富的獼猴桃野生種質資源為獼猴桃屬植物的系統(tǒng)進化研究、品種選育和產業(yè)發(fā)展提供了條件。

由于獼猴桃為雌雄異株植物，染色體倍性呈現(xiàn)多倍化，種間和品種間的雜交嚴重，導致遺傳背景錯綜復雜，譜系親緣關系模糊不清，嚴重影響到獼猴桃種質鑒定、品種改良和新品種的培育與開發(fā)利用。中華獼猴桃(Actinidiachinensis)和美味獼猴桃(A.chinensisvar.deliciosa)存在較為廣泛的野外居群的重疊分布[5]，使得雜交后代存在豐富的基因型和表型。因此，加強對獼猴桃種質資源遺傳多樣性與進化的研究對獼猴桃種質資源保護和利用以及新品種培育具有重要意義。起始密碼子多態(tài)性(Start condon targeted polymorphism，SCoT)是COLLARD等[6]根據(jù)植物基因組ATG翻譯起始位點側翼序列的保守性而開發(fā)的一種目的基因分子標記，其操作簡單方便，引物遺傳信息豐富，多態(tài)性好。目前，SCoT分子標記已被成功應用于菊花、地黃、桂花、梨等多種植物的遺傳多樣性研究，特別是在遺傳多樣性、種質鑒定、遺傳連鎖圖譜建立等方面取得較多進展[7-10]。在獼猴桃種質資源多樣性研究方面，簡單重復序列間擴增多態(tài)性(ISSR)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、隨機擴增多態(tài)性(RAPD)等分子標記已經成功應用于獼猴桃種質資源的遺傳多樣性研究[11-13]，而應用SCoT分子標記的研究尚較少。陳伯倫等[14]利用SCoT分子標記對17個獼猴桃品種(系)進行遺傳多樣性和變異鑒定，發(fā)現(xiàn)3個變異株系均與對照品種(紅陽和金桃)有一定的親緣關系，可以有效區(qū)分獼猴桃性狀變異。本研究運用SCoT分子標記技術，對28份獼猴桃種質資源的遺傳多樣性和親緣關系進行分析，為獼猴桃種質關系鑒定、優(yōu)良基因型挖掘和保護、新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為美味獼猴桃、中華獼猴桃以及近緣種，共28份，分別來源于河南、陜西、貴州等地。其中，美味獼猴桃種質包含米坪行上1號、寨根3號、實生2號等。中華獼猴桃種質包含通山5號、華光2號、華光3號等。近緣種為大籽獼猴桃(A.macrosperma)、軟棗獼猴桃(A.arguta，雌、雄)。利用無菌水和75%乙醇，將采集的獼猴桃植株新鮮幼嫩葉片沖洗干凈，分別放置于裝有硅膠的采集袋中，保存于-20 ℃的冰箱。供試獼猴桃材料信息見表1。

表1 28份供試獼猴桃種質的名稱及來源Tab.1 Name and origin of 28 tested Actinidia germplasms used in the experiment

1.2 基因組DNA提取

利用植物基因組DNA提取試劑盒，采用改良CTAB法提取獼猴桃基因組DNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。提取的樣品基因組DNA用核酸微量測定儀稀釋至一致濃度(50 ng/μL)，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SCoT-PCR反應體系建立

參考袁王俊等[7]、和世玉等[9]和楊珂等[10]的SCoT-PCR方法并進行探索，建立獼猴桃SCoT-PCR反應體系與擴增程序。SCoT-PCR的反應體系：總體積20 μL，其中2×TaqPlus Master Mix 10.0 μL、SCoT引物1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、ddH2O 8.0 μL。反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性50 s，退火50 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 引物篩選與SCoT-PCR擴增

供篩選所用的55條SCoT分子標記引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。隨機選取5個獼猴桃種質的模板DNA，進行SCoT-PCR擴增。通過對PCR擴增產物進行凝膠電泳多態(tài)性指紋圖譜檢測，最終篩選出多態(tài)性高、重復性好、位點清晰的8條引物用于所有供試材料的遺傳分析。篩選出的引物信息如表2所示。采用篩選出的8條SCoT標記引物對28份獼猴桃材料基于優(yōu)化反應體系和擴增程序進行PCR擴增，利用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在核酸凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照、保存。

表2 篩選出的8條SCoT引物序列及其退火溫度Tab.2 The sequences of 8 screened SCoT primers and annealing temperatures

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)核酸多態(tài)性擴增圖譜，以“0/1”統(tǒng)計SCoT擴增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立引物擴增的“0/1”分子數(shù)據(jù)矩陣，并依據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)格式轉換。采用POPGEN 32軟件計算SCoT引物擴增的位點總數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)、多態(tài)性位點百分率。利用NTSYS軟件，計算獼猴桃種質間遺傳相似系數(shù)，基于遺傳相似系數(shù)進行UPGMA(Unweighted pair group method analysis)聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SCoT擴增多態(tài)性分析結果

如表3所示，8條SCoT引物對28份獼猴桃種質材料共擴增出75條帶，平均每條引物擴增出9.4條。其中，位點多態(tài)性條帶數(shù)為73條，平均每條引物擴增出9.1條多態(tài)性條帶，位點多態(tài)性比率為97.3%，多態(tài)性范圍在88.9%～100.0%，顯示篩選的8條SCoT引物標記具有較高的多態(tài)性。圖1為引物SCoT-14、SCoT-21和SCoT-31對28份獼猴桃材料的SCoT標記多態(tài)性擴增圖譜。從擴增結果來看，SCoT引物的擴增產物片段大小主要分布在250～2 000 bp，不同引物在同一種質材料中產生的位點信息存在差異，相同引物在不同種質材料中的位點信息也存在差異，顯示供試的獼猴桃種質材料在基因組DNA水平上具有明顯的差異。

表3 SCoT引物的擴增多態(tài)性信息Tab.3 Amplification polymorphic information of SCoT primers

圖1 引物SCoT-14、SCoT-21和SCoT-31對28份獼猴桃種質的PCR擴增圖譜Fig.1 PCR amplification fingerprint of 28 Actinidia germplasms with primer SCoT-14,SCoT-21,SCoT-31

2.2 獼猴桃種質遺傳多樣性分析結果

28份獼猴桃種質資源的遺傳相似系數(shù)在0.47～0.86，平均值為0.59，變幅為0.39，顯示供試的28份獼猴桃樣本遺傳多樣性較為豐富(表4)。其中，美味獼猴桃實生2號與實生3號、中華獼猴桃華光2號與美味獼猴桃實生2號的遺傳相似系數(shù)均為0.47，顯示它們之間的親緣關系較遠。而美味獼猴桃陳陽與日本國立10號的遺傳相似系數(shù)為0.86，表明它們之間的親緣關系較近。

2.3 獼猴桃種質聚類分析結果

如圖2所示，在遺傳相似系數(shù)0.64處可將28份獼猴桃樣本劃分為3個明顯的聚類分支。聚類群Ⅰ包含18個美味獼猴桃品種、4個中華獼猴桃品種以及2個軟棗獼猴桃[軟棗獼猴桃(雌)和軟棗獼猴桃(雄)]。聚類群Ⅱ包含2個中華獼猴桃品種華光2號和華光3號，以及1個大籽獼猴桃，顯示這2個中華獼猴桃品種的遺傳變異較明顯。聚類群Ⅲ包含1個美味獼猴桃品種實生2號，顯示該株系在進化上較為獨立。在遺傳相似系數(shù)0.70處，聚類群Ⅰ可分為Ia、Ib、Ic、Id、Ie 5個亞分支。其中，Ia分支包含2個美味獼猴桃；Ib分支包含米坪行上2號和二郎坪栗坪1號2個美味獼猴桃，以及雙龍1號和武寧魁2個中華獼猴桃；Ic分支包含13個美味獼猴桃，如實生3號、陳陽、秦香、米良1號、通渠1號、貴蜜、長安1號、徐洲75-2、北京215、金魁、日本國立10號、艾博特、海沃德2-3，以及1個中華獼猴桃通山5號；在Id分支，美味獼猴桃寨根3號與軟棗獼猴桃(雌)和軟棗獼猴桃(雄)聚類。聚類群Ⅰ的聚類關系表明，美味獼猴桃與中華獼猴桃以及軟棗獼猴桃具有較近的親緣關系。

圖2 基于SCoT標記的28份獼猴桃種質UPGMA系統(tǒng)聚類結果Fig.2 UPGMA dendrogram of 28 Actinidia germplasms based on SCoT markers

3 結論與討論

與其他分子標記相比，SCoT標記為研究者提供了一種能夠有效跟蹤性狀并獲得與性狀相關目的基因的新型分子標記[15]。本研究對SCoT-PCR反應體系和擴增程序進行優(yōu)化，并從55條SCoT引物中最終篩選出8條用于獼猴桃種質資源鑒定和遺傳多樣性分析。結果發(fā)現(xiàn)，平均每條SCoT引物擴增出9.4個位點，位點多態(tài)性比率達97.3%，顯示了較好的擴增效果。28份獼猴桃材料的遺傳相似系數(shù)在0.47～0.86，平均值為0.59，變幅為0.39，表明供試的獼猴桃種質間遺傳差異較大，存在較豐富的遺傳多樣性，獼猴桃種內遺傳相似性較高，種間遺傳相似性較低。

表4 基于SCoT標記的28份獼猴桃種質資源的遺傳相似系數(shù)Tab.4 Genetic similarity coefficient of 28 Actinidia germplasm resources based on SCoT markers

本研究獼猴桃種質聚類關系分析顯示，28份獼猴桃種質資源在遺傳相似系數(shù)為0.64水平處被劃分為3個明顯的聚類群，在聚類群Ⅰ中，中華獼猴桃與美味獼猴桃種質聚類，表明中華獼猴桃與美味獼猴桃具有較高的遺傳相似性，種質親緣關系較近，遺傳關系復雜，推測中華獼猴桃與美味獼猴桃在種群進化中發(fā)生了基因漸滲或雜交，該結論與傳統(tǒng)形態(tài)分類學和分子標記技術研究結論一致，進一步論證了美味獼猴桃可能作為中華獼猴桃的硬毛品種[2,16-18]。此外，2個軟棗獼猴桃與美味獼猴桃和中華獼猴桃聚類在類群Ⅰ中，顯示三者的遺傳關系復雜，可能有共同的父系祖先，與基于葉綠體cpDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析結論基本一致[19]。在聚類群Ⅱ中，2個中華獼猴桃品種華光2號和華光3號與1個大籽獼猴桃聚類，顯示部分中華獼猴桃遺傳變異水平較高，種質進化較為明顯，中華獼猴桃與大籽獼猴桃有較近的遺傳關系。

本研究基于SCoT分子標記的獼猴桃種質資源多樣性分析表明，獼猴桃種質資源間具有豐富的遺傳多樣性，美味獼猴桃和中華獼猴桃具有相對較近的親緣關系，種質群體間可能發(fā)生了基因漸滲和雜交，種間存在較近的親本起源和進化。SCoT分子標記可有效用于獼猴桃種質資源的鑒定和遺傳多樣性研究，為獼猴桃品種改良和新品種選育提供理論支持，為伏牛山野生獼猴桃種質資源保護和利用提供參考。