小麥幼苗根系應(yīng)答重金屬Pb脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

王怡仁，聶夢杰，王玉泉，胡喜貴，丁位華，胡鐵柱

(河南科技學(xué)院 小麥中心/河南省雜交小麥重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了大量污水灌溉及農(nóng)藥、除草劑、化肥過度使用等情況，導(dǎo)致土壤中的重金屬含量明顯增加[1]。積累在土壤中的重金屬經(jīng)植物吸收和轉(zhuǎn)運后進入食物鏈，被動物和人類食用并在其體內(nèi)積累，最終對植物、動物和人產(chǎn)生極強的毒害作用[2]。重金屬是目前主要的環(huán)境污染源，同時也是制約植物生長和影響農(nóng)產(chǎn)品安全的重要因素[3-5]。

鉛(Pb)是一種常見的重金屬，是毒性很強的植物生長非必需元素[6]，可抑制植物的生長和發(fā)育[7]。研究表明，Pb脅迫可危害植物根系，造成根系生理代謝失調(diào)，吸收能力減弱，導(dǎo)致營養(yǎng)虧缺，進而影響植株地上部生長和生物量積累[8]；Pb會干擾植物對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，還會對植物的光合作用造成嚴(yán)重的影響[9-11]；當(dāng)Pb在植物根、莖或葉中不斷積累后會影響植物的生長發(fā)育[12-13]。此外，Pb會通過食物鏈進入人體，極易在人體內(nèi)積累，對人體神經(jīng)、腎臟、心血管等造成危害[14]，同時還會通過呼吸道進入肺部或通過皮膚接觸侵入體內(nèi)，進而對人體的造血系統(tǒng)造成危害，引起貧血和神經(jīng)系統(tǒng)末梢神經(jīng)炎等[15]。Pb還可以隨血液流入腦組織，損害小腦和大腦皮質(zhì)細(xì)胞，干擾新陳代謝，引起腦損傷[16]。Pb污染是一個重要的生態(tài)問題，受Pb污染的土壤在世界范圍內(nèi)急劇增加，其對人體健康的危害逐漸引起全世界的關(guān)注[17]。

小麥(Triticumaestivum)是我國重要的糧食作物。關(guān)于重金屬Pb對小麥的影響研究主要集中于小麥生理生化及農(nóng)藝性狀方面[18-19]。對小麥根系的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬Pb能干擾根細(xì)胞分裂，抑制根系生長發(fā)育，使根系生物量和體積下降，最終對根系的生理生化特性產(chǎn)生影響[20]。根系作為植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，也是植物最早遭受重金屬脅迫的組織，了解根系對逆境脅迫的反應(yīng)，是系統(tǒng)認(rèn)識逆境傷害機制的較好途徑。從轉(zhuǎn)錄組層面深入研究小麥根系對Pb的吸收、轉(zhuǎn)運以及積累，對于保證人類健康有重要意義[21]。目前，從轉(zhuǎn)錄組水平分析小麥根系對Pb脅迫的應(yīng)答研究尚未見報道。為此，采用水培法對不同質(zhì)量濃度Pb脅迫下的小麥幼苗根系進行掃描和Illumina Hiseq高通量測序，探討小麥幼苗根系對重金屬Pb脅迫的響應(yīng)情況，為深入研究重金屬Pb脅迫對小麥生長發(fā)育的影響機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及Pb脅迫處理

供試小麥品種為矮抗58。首先，在超凈工作臺中選取大小一致、顆粒飽滿的小麥種子放入無菌三角瓶中，用1.0 g/L的HgCl2浸泡消毒10 min。隨后用去離子水洗干凈，放置于發(fā)芽機中發(fā)芽。3 d后，選取長勢一致的幼苗分別移栽至含有40 mg/L(R1)、80 mg/L(R2)和160 mg/L(R3)Pb(NO3)2的Hoagland營養(yǎng)液中，以未添加Pb(NO3)2的Hoagland營養(yǎng)液為對照(CK)。15 d后，各處理選取長勢一致的小麥進行根系掃描，經(jīng)液氮速凍放入-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥根長、根數(shù)測定 使用根系掃描儀對小麥幼苗根系進行掃描，統(tǒng)計得出根長及根數(shù)。

1.2.2 小麥幼苗根系轉(zhuǎn)錄組測序 小麥幼苗根系總RNA由柏豪生物技術(shù)有限公司采取Trizol法抽提并完成測序文庫的構(gòu)建，利用Illumina Hiseq 2500平臺進行測序，在測序過程中對測序數(shù)據(jù)采用邊測序邊分析的方法進行實時分析。

1.2.3 序列比對與差異表達(dá)基因篩選 應(yīng)用Hisat2[22]將測序數(shù)據(jù)與參考基因組序列(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-41/plants/fasta/triticum_aestivum/dna/Triticum_aestivum.IWGSC.dna.toplevel.fa.gz)進行比對。采用edgeR[23]分析樣本間的差異表達(dá)基因，得出P值后進行多重假設(shè)驗證，并通過控制FDR(False discovery rate)決定P值的閾值[24-25]。同時，基于FPKM值計算基因差異表達(dá)倍數(shù)，即Fold-change，進行差異表達(dá)基因的篩選，篩選條件：P≤0.05、|log2(Fold-change)|≥2。

1.2.4 差異表達(dá)基因的功能注釋與富集分析 分別利用GOseq和KOBAS[26]對篩選得到的差異表達(dá)基因進行GO(Gene ontology)分類與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-PCR)分析 為了檢驗RNA-Seq的可靠性，選取80 mg/L Pb脅迫處理與CK中差異表達(dá)的6個基因，采用RT-PCR分析其表達(dá)量。差異表達(dá)基因的引物采用Primer Express 3.0.1軟件設(shè)計，引物序列見表1。內(nèi)參基因為β-actin，引物為β-actin-F(5′-TCTCGGTTCAGCTTTTCCTT-3′)和β-actin-R(5′- TTCATACAGCAGGCAAGCAC-3′)。RT-PCR擴增程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算基因的表達(dá)量，每個樣品3次重復(fù)。

表1 采用的RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences used in study

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010進行處理和作圖，利用 SPSS 19.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度Pb處理對小麥幼苗根系的影響

由圖1和表2可知，不同質(zhì)量濃度Pb對小麥幼苗根長及根數(shù)都有影響。在CK下，小麥幼苗根長及根數(shù)分別為26.27 cm和5.7個，隨著Pb質(zhì)量濃度逐漸升高，根長與根數(shù)受到的抑制作用越來越明顯。其中，R1處理的小麥幼苗根長、根數(shù)受到顯著抑制，根長和根數(shù)分別為23.26 cm和5.5個；R2處理下的根長、根數(shù)均受到更顯著抑制，根長和根數(shù)分別為21.16 cm和5.2個；R3處理下，根長和根數(shù)分別為17.38 cm和4.8個，均受到極顯著抑制。

圖1 不同質(zhì)量濃度Pb處理下小麥幼苗根系的掃描情況Fig.1 Wheat seedling root scan under different concentrations of Pb

2.2 小麥幼苗根系轉(zhuǎn)錄組測序分析

將CK與Pb脅迫處理小麥幼苗根系樣品進行高通量測序。各樣品測序后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)均達(dá)到12 Gb，測序質(zhì)量質(zhì)控值(Q20)均大于95.0%，說明測序結(jié)果質(zhì)量良好，將獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因序列進行比對，如表3所示。每個測序樣品與參考基因組唯一位置上的比對效率均在86.93%以上，比對效果良好。

表2 不同質(zhì)量濃度Pb處理對小麥幼苗根長及根數(shù)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of Pb on root length and root number of wheat seedlings

注：*、**分別表示Pb處理與CK間差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。
Note:*,** indicate significant differences between Pb treatment and CK at 0.05,0.01 levels，respectively.

表3 小麥幼苗根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對質(zhì)量分析Tab.3 Mapped quality of transcriptome data in wheat seedling root

2.3 小麥幼苗根系中差異表達(dá)基因的篩選

對不同質(zhì)量濃度Pb處理與CK間的小麥幼苗根系差異表達(dá)基因進行分析，一共獲得了38 904個差異表達(dá)基因，40、80、160 mg/L Pb處理條件下的差異表達(dá)基因分別為6 072、16 581、16 251個。在所有Pb處理中下調(diào)表達(dá)基因居多。其中，在40 mg/L Pb處理條件下有3 218(53%)個基因表達(dá)下調(diào)、2 854(47%)個基因表達(dá)上調(diào)；80 mg/L Pb處理條件下有10 769(65%)個基因表達(dá)下調(diào)、5 812(35%)個基因表達(dá)上調(diào)；160 mg/L Pb處理條件下有10 661(65%)個基因表達(dá)下調(diào)、5 590(35%)個基因表達(dá)上調(diào)。在80 mg/L Pb處理條件下呈現(xiàn)的差異表達(dá)基因數(shù)量最多且表型趨于臨界狀態(tài)，所以選取該質(zhì)量濃度下的差異表達(dá)基因作為本研究的重點。

2.4 小麥幼苗根系中差異表達(dá)基因的GO分類

對CK與80 mg/L Pb處理之間獲得的小麥幼苗根系差異表達(dá)基因進行GO分類。由圖2可知，上調(diào)表達(dá)基因主要富集在生物學(xué)過程中的免疫系統(tǒng)過程、運動過程、代謝過程和節(jié)律性過程等4個亞類；在細(xì)胞組分方面，主要富集在細(xì)胞器和細(xì)胞核2個亞類；此外，在分子功能方面，顯著富集在催化活性和電子載體活性2個亞類。

小麥幼苗根系中下調(diào)表達(dá)基因的GO分類與上調(diào)表達(dá)基因不同。如圖3所示，在生物學(xué)過程中，下調(diào)表達(dá)基因主要富集在發(fā)育過程、生長過程、定位過程、復(fù)制過程和生殖過程等5個亞類；在細(xì)胞組分方面，主要富集在細(xì)胞連接、胞外區(qū)域、膜和共質(zhì)體等4個亞類；在分子功能方面，主要富集在抗氧化活性、信號傳感活性、結(jié)構(gòu)分子活性和轉(zhuǎn)運活性等4個亞類。

圖2 80 mg/L Pb處理小麥幼苗根系中上調(diào)表達(dá)基因的GO分類Fig.2 Classification of up-regulated genes of 80 mg/L Pb treatment in wheat seedling root compared with CK

圖3 80 mg/L Pb處理小麥幼苗根系中下調(diào)表達(dá)基因的GO分類Fig.3 Classification of down-regulated genes of 80 mg/L Pb treatment in wheat seedling root compared with CK

2.5 小麥幼苗根系中差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

通過KEGG對80 mg/L Pb處理與CK間的差異表達(dá)基因主要富集的代謝通路進行分析，如圖4所示。上調(diào)表達(dá)基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其次是植物-病原互作途徑、藥物代謝途徑、MAPK信號通路等；下調(diào)表達(dá)基因主要富集在次生代謝物的生物合成途徑，其次是苯丙烷類生物合成途徑、抗生素生物合成途徑、碳代謝和蔗糖代謝等。由此可知，在Pb脅迫下植物通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活MAPK信號通路，同時植物體內(nèi)的碳代謝以及蔗糖代謝均有明顯變化。

圖4 80 mg/L Pb處理小麥幼苗根系差異表達(dá)基因的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes of 80 mg/L Pb treatment in wheat seedling root compared with CK

通過上述GO分類和KEGG的富集分析發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)基因中篩選出了2個差異最顯著的基因PETF(TraesCS7B02G226100)和PR4B(TraesCS3D02G524700)，它們分別富集在發(fā)育過程和免疫系統(tǒng)過程；在下調(diào)基因中篩選出共同富集在代謝途徑、次生代謝物的生物合成和苯丙烷類生物合成等途徑的基因GLU1B(TraesCS2B02G599800)、GLU1C(TraesCS2D02G594400)、GLU1D(TraesCSU02G036600)和OMT1(TraesCS7B02G245500)，用于RT-PCR分析。

2.6 小麥幼苗根系中差異表達(dá)基因RT-PCR結(jié)果分析

對上述6個響應(yīng)Pb脅迫的基因進行RT-PCR驗證，如圖5所示，6個差異表達(dá)基因的RT-PCR結(jié)果與RNA-Seq的分析結(jié)果一致，證實了RNA-Seq分析結(jié)果的可靠性。

圖5 差異表達(dá)基因的RT-PCR驗證Fig.5 Validation of differentially expressed genes using RT-PCR

3 結(jié)論與討論

在過去的10 a內(nèi)，耕作土壤中重金屬含量大大增加[27]，包括小麥在內(nèi)的大多數(shù)農(nóng)作物在污染的環(huán)境中均遭受重金屬的毒害[28]。前人關(guān)于重金屬對作物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響研究認(rèn)為，較低重金屬濃度對作物種子萌發(fā)和幼苗生長有促進作用，高濃度具有抑制效應(yīng)[29]。本研究通過對小麥幼苗根系掃描對比發(fā)現(xiàn)Pb對根長和生根數(shù)產(chǎn)生影響，且隨著Pb質(zhì)量濃度的升高抑制作用越來越明顯。Pb毒害引起植物的中毒癥狀主要為根量減少，根冠膨大變黑、腐爛，植物地上部分生物量下降，葉片失綠明顯，嚴(yán)重時逐漸枯萎，植株死亡[30]。

本研究對Pb處理與CK的根系進行Illumina Hiseq高通量測序，共獲得38 904個差異表達(dá)基因。其中，在40、80、160 mg/L Pb處理中分別有6 072、16 581、16 251個差異表達(dá)基因，且在所有處理中均以下調(diào)基因居多。隨著Pb質(zhì)量濃度升高，差異表達(dá)基因數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，說明絕大多數(shù)基因的表達(dá)水平對Pb處理的質(zhì)量濃度比較敏感，大多數(shù)基因只在特定的質(zhì)量濃度下表達(dá)水平才出現(xiàn)差異。GO功能分類發(fā)現(xiàn)，80 mg/L Pb處理與CK間的差異表達(dá)基因主要富集在免疫系統(tǒng)過程、運動過程、代謝過程、節(jié)律性過程、發(fā)育過程、生長過程、定位過程、復(fù)制過程和生殖過程等，與之前苜蓿芽孢桿菌受到Cd脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致[31]。另外，還富集在細(xì)胞組分中的細(xì)胞器、細(xì)胞核、細(xì)胞連接、胞外區(qū)域、膜和共質(zhì)體等；在分子功能方面，主要富集在催化活性、電子載體活性、抗氧化活性、信號傳感活性、結(jié)構(gòu)分子活性和轉(zhuǎn)運活性，這可能是植物受到重金屬Pb脅迫時的一種應(yīng)激反應(yīng)。

在80 mg/L Pb處理中挖掘到了6個應(yīng)答重金屬Pb脅迫的候選基因。PETF作為上調(diào)基因富集在發(fā)育過程中，另一個上調(diào)基因PR4B富集在免疫系統(tǒng)過程中。眾所周知，光合作用是植物生長發(fā)育的重要能量來源和物質(zhì)基礎(chǔ)，當(dāng)小麥?zhǔn)艿街亟饘倜{迫時，通過提高PETF和PR4B的表達(dá)量緩解毒害。另外，還發(fā)現(xiàn)了GLU1B、GLU1C、GLU1D和OMT1等基因在Pb處理中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。它們在代謝途徑、次生代謝物的生物合成和苯丙烷類生物合成等途徑顯著富集。本研究中，GLU1B、GLU1C、GLU1D編碼葡萄糖苷酶GLU1，葡萄糖苷酶是糖苷水解酶家族中的一大類酶，是生物體代謝途徑中不可或缺的一類酶。OMT1是與黃酮代謝相關(guān)的基因。由此可見，Pb脅迫會降低小麥幼苗根系GLU1基因、黃酮代謝相關(guān)基因的表達(dá)量來影響植物的生長發(fā)育。