重組雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及鑒定

田志雄，李娜娜，盧曉曉，2，郭 敏，張 寧，李 欣，張 鼎，趙宇軍，閆 芳，高榮琨，寧官保，田文霞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.溫縣農(nóng)林局，河南溫縣454850；3.晉城市科學(xué)技術(shù)局，山西晉城048000）

包括脂肪酸（FAs）等在內(nèi)的脂類(lèi)是所有細(xì)胞的基本生化組成，具有多種生物學(xué)作用，即作為生物膜的結(jié)構(gòu)成分、能量來(lái)源和一系列細(xì)胞調(diào)節(jié)功能等[1]。脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）是一種質(zhì)量較小的水溶性蛋白，迄今為止，已鑒定出12個(gè)FABP家族成員，其中，10個(gè)亞型也在人類(lèi)中表達(dá)[2-3]。FABPs主要參與動(dòng)物體內(nèi)的脂肪酸代謝，具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力[4]。細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白（Extracellular Fatty Acid-binding Protein，Ex-FABP）是一種雞胚發(fā)育過(guò)程中表達(dá)于肥大軟骨、肌肉纖維和血粒細(xì)胞中的脂蛋白，最初命名為Ch21，后來(lái)由于其結(jié)合特性而被重新命名為Ex-FABP[5]。這個(gè)低分子量蛋白屬于lipocalin家族，其家族共享相似的b-桶三級(jí)結(jié)構(gòu)[6]。因此，細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白與親脂性小分子物質(zhì)（如類(lèi)維生素A、脂肪酸、膽固醇、前列腺素、信息素和增香劑等）具有相同的功能[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，胞外脂肪酸結(jié)合蛋白還具有控制細(xì)胞凋亡的功能[8]。

本試驗(yàn)通過(guò)原核表達(dá)方法克隆雞Ex-FABP基因，將目的基因連接到克隆載體pGEM-TEasy上，然后與pET-28a（+）載體連接，并轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，最后經(jīng)鑒定得到Ex-FABP蛋白，旨在為后續(xù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)以及家禽疾病的研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

pET-28a載體由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol、PCR聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；DNA ladder、DNA loading buffer購(gòu)自中科瑞泰生物有限公司；Agarose-G10購(gòu)自Biowest公司；限制性核酸內(nèi)切酶Eco RⅠ、XhoⅠ購(gòu)自New England Biolabs公司；pGEM-TEasy克隆載體購(gòu)自Promega公司；SDS、Glycine、Coomassie Blue Staining Solution和50×TAE緩沖液購(gòu)自北京博奧拓達(dá)公司；Anti-6×His tag抗體購(gòu)自Abcam公司；Carnamycin sulfate、SYBRGreen I核酸染料、氨芐青霉素、丙烯酰胺、Imidazole、甲叉丙烯酰胺、Ammoniumpersulphate、四甲基乙二胺、蛋白Marker、麗春紅、羊抗小鼠IgG二抗和NC膜購(gòu)自Solarbio科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 按照NCBI中公布的雞Ex-FABP基因序列（AF121346.1），通過(guò)使用DNAMAN、Primer軟件設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物添加酶切位點(diǎn)Eco RI和Xho I以及保護(hù)性堿基。

上游引物：5′-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCC GGA-3′；下游引物：5′-AGCTCTCGAGCTACACTTC ATCAAGCTGCAT-3′。

1.2.2 Ex-FABP基因克隆與鑒定 取雞的脛骨生長(zhǎng)板，使用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，并回收目的條帶。

1.2.3 雞Ex-FABP重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定采用雙載體系統(tǒng)構(gòu)建目的質(zhì)粒，即首先將目的基因連接到克隆載體pGEM-TEasy上，獲得重組克隆質(zhì)粒T-Ex-FABP；然后取適量重組克隆質(zhì)粒T-Ex-FABP和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）同時(shí)進(jìn)行酶切，并檢測(cè)結(jié)果；用T4 DNA連接酶將Ex-FABP基因和pET-28a（+）載體連接，并轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，接于LB板上，通過(guò)Kana抗性選出陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定；將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序分析，獲得表達(dá)載體pET-28a-Ex-FABP。

1.2.4 Ex-FABP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化將重組質(zhì)粒pET-28a-Ex-FABP轉(zhuǎn)入到BL21（DE3），接種到含Kana的LB板上，37℃培養(yǎng)12 h；隨機(jī)挑取單菌落于含Kana的LB培養(yǎng)基，當(dāng)OD600為0.5～0.7時(shí)添加IPTG誘導(dǎo)；誘導(dǎo)結(jié)束后進(jìn)行細(xì)菌破碎，12 000 r/min 4℃離心30 min，然后分別通過(guò)SDSPAGE鑒定沉淀或上清中蛋白表達(dá)情況。

鑒定蛋白表達(dá)形式后，菌液繼續(xù)進(jìn)行分組誘導(dǎo)培養(yǎng)，以摸索誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。分別從IPTG濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）、誘導(dǎo)溫度（25、30、37℃）、誘導(dǎo)時(shí)間（6、12、21 h）3個(gè)方面來(lái)檢測(cè)誘導(dǎo)條件對(duì)Ex-FABP表達(dá)的影響。

1.2.5 Ex-FABP重組蛋白的純化 以最佳的誘導(dǎo)條件繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，之后收集菌體，PBS洗菌3次，使用超聲波裂解破碎細(xì)菌，吸取上清，用無(wú)菌濾器過(guò)濾。本試驗(yàn)選擇的載體為pET-28a（+），攜帶有His標(biāo)簽，可直接進(jìn)行鎳柱層析法純化蛋白。將無(wú)菌過(guò)濾的樣品與Binding Buffer等比例混合上柱，分別用不同濃度（10、20、30、40 mmol/L）的咪唑洗雜，用500 mmol/L的咪唑沖洗Ex-FABP蛋白，收集Ex-FABP蛋白，通過(guò)SDS-PAGE鑒定結(jié)果。

1.2.6 Western Blot鑒定Ex-FABP重組蛋白 SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，用麗春紅染色，再用蒸餾水洗脫，脫色后的膜加入TBST稀釋的5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉；加入用1∶1 000稀釋的Anti-6×His tag抗體，4℃孵育4 h；回收抗體后用TBST洗滌3次；再加入用TBST按1∶5 000稀釋的IgG抗體，37℃搖動(dòng)孵育1 h；TBST洗滌后取出NC膜，將ECL發(fā)光液均勻覆蓋于膜表面，放入暗盒中觀察，掃描記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

預(yù)期的Ex-FABP基因大小為495 bp，在500 bp左右出現(xiàn)條帶（圖1），表明擴(kuò)增得到了目的基因Ex-FABP。

2.2 重組克隆質(zhì)粒T-Ex-FABP的序列測(cè)定結(jié)果

菌液PCR結(jié)果顯示，在500 bp左右出現(xiàn)特異性條帶（圖2），提取質(zhì)粒后送上海美吉生物公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，序列同源性為99%，表明重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 p ET-28a-Ex-FABP表達(dá)載體的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒用Eco RⅠ和XhoⅠ同時(shí)酶切后進(jìn)行鑒定，可見(jiàn)相應(yīng)的2條電泳帶（圖3），并且Ex-FABP基因在500 bp左右位置，序列經(jīng)過(guò)分析后完全正確，證明重組pET-28a-Ex-FABP質(zhì)粒連接成功；同時(shí)空質(zhì)粒pET-28a也進(jìn)行雙酶切，結(jié)果顯示，有相應(yīng)的一條帶（圖3）。

2.4 Ex-FABP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

2.4.1 Ex-FABP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組載體轉(zhuǎn)入BL21（DE3），得到含有目的基因的BL21/Ex-FABP，誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，加上His標(biāo)簽后Ex-FABP蛋白大約是24 ku，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后菌液在20.1～31.0 ku有一條帶；未誘導(dǎo)菌液在相同位置無(wú)條帶（圖4）。并且，Ex-FABP重組蛋白在上清和沉淀中均有分布，取同等上樣量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上清中蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)高于沉淀（圖5）。

2.4.2 Ex-FABP重組蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化 利用SDS-PAGE對(duì)蛋白表達(dá)的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，0.2 mmol/L IPTG、30℃、21 h為Ex-FABP重組蛋白表達(dá)的最佳條件（圖6～8）。

2.5 Ex-FABP重組蛋白的純化及鑒定

2.5.1 Ex-FABP重組蛋白的純化 Ex-FABP重組蛋白的裂解液上清經(jīng)純化后，用500 mmol/L的咪唑沖洗，可得到較純的目的蛋白（圖9）。

2.5.2 Ex-FABP重組蛋白的免疫印跡鑒定結(jié)果由圖10可知，通過(guò)Western Blot鑒定純化后，上清中出現(xiàn)單一特異性條帶，即純化得到目的蛋白Ex-FABP；而未誘導(dǎo)菌液中無(wú)條帶。

3 結(jié)論與討論

脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）是一類(lèi)與配體相關(guān)的水溶性蛋白，其大小為14～15 ku，在與高代謝活性和脂質(zhì)存儲(chǔ)相關(guān)的組織中大量表達(dá)，迄今為止，已鑒定出12個(gè)FABP家族成員[9-10]。盡管最初是根據(jù)首次描述FABP表達(dá)的組織類(lèi)型命名，但是后來(lái)發(fā)現(xiàn)有些FABP成員在多個(gè)組織中都有表達(dá)，并且可以共同表達(dá)。雖然FABP家族成員只表現(xiàn)一定的序列同源性，但是不同家族成員之間的三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相似，由10條反平行的β鏈組成，形成β桶結(jié)構(gòu)[3]。FABP表達(dá)的失調(diào)可能是通過(guò)基因突變或環(huán)境生活方式的影響而發(fā)生。近年來(lái)，F(xiàn)ABP在腫瘤生物學(xué)中的作用越來(lái)越多地被報(bào)道，外源性FABP的表達(dá)升高與腫瘤的進(jìn)展和侵襲性有關(guān)，但內(nèi)源性FABP過(guò)表達(dá)的作用還有待進(jìn)一步研究。

Ex-FABP是一類(lèi)不含甘露糖的蛋白質(zhì)，具有鏈內(nèi)二硫鍵構(gòu)象，可抵抗有限的胃蛋白酶消化[11]。BEDARD等[12]也發(fā)現(xiàn)了相同的蛋白，分泌于雞胚成纖維細(xì)胞和雞心臟間充質(zhì)細(xì)胞，稱(chēng)為p20K蛋白。ExFABP和p20K都是禽類(lèi)蛋白，在其他物種特別是小鼠和人中還沒(méi)有明確的同源性。在分化軟骨和肌管時(shí)，炎癥因子（脂多糖等）明顯上調(diào)Ex-FABP蛋白合成；而抗炎藥抑制生理表達(dá)的蛋白合成，并且阻止脂多糖誘導(dǎo)的蛋白合成[13]，表明Ex-FABP可能在肌管分化和成熟過(guò)程中發(fā)揮反饋（自分泌）控制作用，并可能在維持細(xì)胞活力方面發(fā)揮作用[14]。本試驗(yàn)通過(guò)引物設(shè)計(jì)獲取雞Ex-FABP基因，并連接到質(zhì)粒pET-28a（+）上，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）進(jìn)行培養(yǎng)，摸索最佳誘導(dǎo)條件，表達(dá)了大量純度比較高的Ex-FABP蛋白，結(jié)果為后續(xù)的動(dòng)物試驗(yàn)以及家禽疾病的研究提供了依據(jù)。

本試驗(yàn)選擇的是原核表達(dá)體系，其可以快速得到大量的目的蛋白，而且所需的成本比較低，方法也比較簡(jiǎn)單，可以表達(dá)的蛋白也比較多[15]。缺點(diǎn)在于表達(dá)出來(lái)的蛋白沒(méi)有經(jīng)過(guò)修飾，不一定有天然的活性[16]，且無(wú)法調(diào)控水平和時(shí)間，蛋白經(jīng)常存在于包涵體中，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難。真核表達(dá)系統(tǒng)雖然可以進(jìn)行相應(yīng)的修飾，但是周期較長(zhǎng)，速度慢，獲得的蛋白產(chǎn)量低。本試驗(yàn)采用的是原核表達(dá)系統(tǒng)，但是Ex-FABP為真核基因，所以后期還需要進(jìn)行加工修飾，即表達(dá)出的蛋白需經(jīng)過(guò)透析等過(guò)程，使蛋白具有功能活性。

在原核體系中，最常用的宿主菌為大腸桿菌，其具有背景明確、快速便捷、產(chǎn)量較高的優(yōu)點(diǎn)[17-18]。目前，在大腸桿菌表達(dá)體系中，最常用的質(zhì)粒有pET、pGEX等。這2種系列表達(dá)質(zhì)粒均帶有純化標(biāo)簽，即His標(biāo)簽和GST標(biāo)簽[19]。而由于His標(biāo)簽具有分子量小、免疫原性低、無(wú)需處理即可進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)等特點(diǎn)，以及考慮到本試驗(yàn)的下游試驗(yàn)所需蛋白要求，故選用了存在His標(biāo)簽的pET-28a（+）質(zhì)粒。而且選擇pET系統(tǒng)表達(dá)蛋白時(shí)，如果不添加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程幾乎不進(jìn)行。本試驗(yàn)根據(jù)pET-28a（+）的質(zhì)粒圖譜，在引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇Eco RⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，使Ex-FABP基因可以順利連接到pET-28a（+）載體上，并且本試驗(yàn)選用了適合pET表達(dá)載體的BL21（DE3）菌株作為宿主菌。

為了得到大量的重組Ex-FABP蛋白，本試驗(yàn)還對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及時(shí)間進(jìn)行了分組測(cè)定，結(jié)果得出，IPTG濃度對(duì)試驗(yàn)沒(méi)有較大影響；溫度為30℃時(shí)的表達(dá)量要高于25、37℃；誘導(dǎo)時(shí)間為21 h時(shí)蛋白表達(dá)量高于6、12h。即IPTG終濃度0.2mmol/L、誘導(dǎo)溫度30℃、誘導(dǎo)時(shí)間21 h為Ex-FABP蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-Ex-FABP，并對(duì)重組Ex-FABP蛋白進(jìn)行了純化、SDS-PAGE和Western Blot鑒定，得到了純度較高的重組蛋白，構(gòu)建了一套雞Ex-FABP蛋白的表達(dá)程序，結(jié)果可為后續(xù)的動(dòng)物試驗(yàn)以及家禽疾病的研究提供理論依據(jù)。