高效液相色譜法測(cè)定紫錐菊中7種酚酸含量及其聚類分析*

孫麗平，齊海艷，鄭洪偉，杜研，楊春娟，甘春麗

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)與天然藥物化學(xué)教研室，哈爾濱 150081；2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽 110016；3.中國(guó)水利水電科學(xué)研究院，北京 100038)

紫錐菊[Echinaceapurpurea(L.) Moench]為菊科松果菊屬多年生草本植物，共有8個(gè)種和數(shù)個(gè)變種，藥用者主要為紫錐菊[E.purpurea(L.) Moench]、狹葉紫錐菊[Echinaceaangustifolia(DC.) Hell]和白紫錐菊[Echinaceapallia(Nutt.) Nutt]，已開發(fā)為藥物主要為前兩種。研究表明，紫錐菊具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎及抗病毒等活性，其提取物在我國(guó)保健品和藥品市場(chǎng)有巨大的發(fā)展?jié)摿1-3]。紫錐菊中含有多種化學(xué)成分，如酚酸類、多糖、烷基酰胺類、倍半萜類、揮發(fā)油、生物堿類和多炔類等。主要活性成分酚酸含量較高，是《美國(guó)藥典》(USP35)用于評(píng)價(jià)藥材的指標(biāo)性成分[4-5]。目前，我國(guó)多個(gè)地區(qū)引進(jìn)紫錐菊，并且栽培成功，但有關(guān)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和商用提取物標(biāo)準(zhǔn)的研究各異，藥材質(zhì)量存在較大差異[6-10]。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)15個(gè)產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分的含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)采用層次聚類分析法對(duì)紫錐菊提取物中酚酸成分進(jìn)行分類歸納，為制定引種紫錐菊及其提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考[11-13]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，Agilent 1260型二級(jí)陣列管檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)，HHS型電熱恒溫水浴鍋(博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，KQ3200E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BP210S電子天平(德國(guó)Satorius公司，感量：0.1 mg)。

1.2主要試藥 紫錐菊藥材購于陜西、河北、湖北、湖南等15個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為菊科松果菊屬植物紫錐菊[Echinaceapurpurea(L.) Moench]。對(duì)照品：3，4-二羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、菊苣酸、香草酸、4-羥基苯甲酸均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量均大于98.0%。無水乙醇、磷酸(分析純，天力化學(xué)有限公司)，甲醇(色譜純，百靈威科技有限公司)，純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Inertsil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流速：0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相：A為0.1%磷酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫：0～10 min，10%→20% B；>10～40 min 20% B；>40～45 min，20%→23% B；>45～50 min，2 3%→34% B；>50～63 min，34%→35% B；>63～0 min 35%→40% B；>70～75 min，40% B。在上述色譜條件下，各組分理論板數(shù)均不低于3000，樣品中各待測(cè)組分與相鄰峰分離度均大于1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取下列對(duì)照品：3，4-二羥基苯甲酸(1)、綠原酸(2)、咖啡酸(3)、丁香酸(4)、對(duì)香豆酸(5)、阿魏酸(6)、菊苣酸(7)適量，分別用甲醇溶解并稀釋成2.083，2.086，2.124，2.102，2.068，2.121，1.963 mg·mL-1的混合對(duì)照品貯備液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取紫錐菊藥材粉末10 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1：20，50 ℃加熱提取2次，每次提取2.5 h。合并提取液，濾過，減壓濃縮至干，加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容搖勻，進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 取3，4-二羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、菊苣酸的混合對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣測(cè)定，各組分理論塔板數(shù)均不低于3000，樣品中各待測(cè)組分與相鄰峰分離度均大于1.5，該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

A.對(duì)照品溶液；B.紫錐菊提取物供試品溶液；1.3，4-二羥基苯甲酸；2.綠原酸；3.咖啡酸；4.丁香酸；5.對(duì)香豆酸；6.阿魏酸；7.菊苣酸。

圖1 紫錐菊提取物中7種酚酸類成分HPLC色譜圖

A.reference solution；B.Echinaceapurpurea extract test solution；1.3，4-dihydroxybenzoic acid；2.Chlorogenic acid；3.Caffeic acid；4.Eugenic acid；5.P-coumaric acid；6.Ferulic acid；7.Cichoric acid.

Fig.1 HPLC chromatogram of seven phenolic acids inEchinaceapurpurea extract

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 精密吸取各對(duì)照品溶液適量，置于量瓶中，用甲醇逐級(jí)稀釋成3，4-二羥基苯甲酸為1.627～104.2 μg·mL-1、綠原酸為5.704～365.1 μg·mL-1、咖啡酸為3.319～212.4 μg·mL-1、丁香酸為3.284～210.2 μg·mL-1、對(duì)香豆酸為2.423～155.1 μg·mL-1、阿魏酸為3.314 ～212.1 μg·mL-1、菊苣酸為12.27～785.2 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，記錄色譜圖，獲取色譜峰面積，以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果見表1，各組分在其相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2> 0.999 6)。

表1 紫錐菊提取物中7種酚酸類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

Tab.1 Standard curve and linear range of seven phenolic acids in Echinacea extract

化合物線性方程R2線性范圍/(μg·mL-1)3,4-二羥基苯甲酸Y=8.295 5X-1.495 50.999 91.627～104.2綠原酸Y=8.787 6X+2.801 30.999 85.704～365.1咖啡酸Y=20.783X+6.612 30.999 73.319～212.4丁香酸Y=17.599X+10.6320.999 73.284～210.2對(duì)香豆酸Y=25.289X+3.639 80.999 82.423～155.1阿魏酸Y=18.645X-2.236 40.999 93.314～212.1菊苣酸Y=11.463X-126.090.999 612.270～785.2

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定，記錄化合物1-7各對(duì)照品的峰面積，并計(jì)算各峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)。結(jié)果RSD分別為2.04%，2.16%，2.06%，1.98%，2.00%，2.02%，1.27%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一產(chǎn)地(陜西)紫錐菊藥材粉末6份，每份10 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定7種酚酸成分的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算濃度及其RSD值。結(jié)果化合物1-7濃度的RSD值分別為1.15%，0.86%，2.04%，0.37%，1.98%，1.60%，0.96%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)提取測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，室溫放置，分別在0，2，4，6，8，12 h分別進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，外標(biāo)法計(jì)算各時(shí)間隔點(diǎn)7種酚酸成分的濃度，并與0 h的濃度比較，計(jì)算RE值。結(jié)果見表2，表明7種酚酸在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一產(chǎn)地(陜西)紫錐菊藥材粉末6份，每份5 g，精密稱定，加入適量化合物1-7到供試樣品中，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，獲取色譜峰面積，外標(biāo)法計(jì)算濃度，計(jì)算各酚酸成分的加樣回收率及RSD值。結(jié)果顯示加入7種酚酸成分樣品的平均加樣回收率為98.41%～101.9%，RSD<3.0%，表明本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠。

2.9樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地同一季節(jié)采收的紫錐菊藥材各10 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算各產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸成分的含量及總酚含量。結(jié)果見表3。

表2 7種酚酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分的聚類分析 聚類分析是一種依據(jù)研究對(duì)象(樣品或指標(biāo))的特征，對(duì)其進(jìn)行分類的方法，以減少研究對(duì)象的數(shù)目。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)所測(cè)不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸成分的定量分析數(shù)據(jù)，使用SPSS 22.0版統(tǒng)計(jì)軟件處理，選用離差平方和法(Ward法)，平方歐式距離(Squared Euclidean distance)作為樣品的測(cè)度，進(jìn)行層次聚類分析。得到不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分含量的樹狀聚類圖譜，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，樣本層次聚類分析結(jié)果根據(jù)不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中酚酸類成分含量的不同大體可以分為兩類：樣本3，7，1，2是一類，說明這類紫錐菊提取物中7種酚酸類成分含量基本相近，剩余樣本為一類。剩余樣本也可以繼續(xù)細(xì)分：樣本6，13，14為一類，樣本4，8，10為一類，樣本5，9，12，15，11為一類。從分析結(jié)果可以看出，不同地區(qū)的樣品各自聚為一類，說明紫錐菊提取物中酚酸類成分含量顯然與地域分布有關(guān)。

3 討論

3.1色譜條件的選擇 實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化，由于7種酚酸類成分極性相近，為了達(dá)到良好的分離度，本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫。結(jié)合文獻(xiàn)，考察不同流動(dòng)相對(duì)樣品分離效果的影響。有機(jī)相采用甲醇-水相考察0.1%磷酸水溶液、0.2%磷酸水溶液和0.5%磷酸水溶液，分別組合挑選最優(yōu)流動(dòng)相。經(jīng)過多次調(diào)整洗脫條件，最終確定以甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相，7種酚酸類成分得到較好地分離，且柱效較高，拖尾現(xiàn)象得到改善。針對(duì)酚酸類成分母核中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，選用DAD檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，在280 nm波長(zhǎng)處各組分均有較大的吸收，確定為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2測(cè)定結(jié)果分析 表3數(shù)據(jù)顯示不同產(chǎn)地紫錐菊提取物的酚酸含量參差不齊，其中陜西產(chǎn)地紫錐菊提取物的酚酸總含量最高，而湖南的最低，兩者含量相差明顯。同時(shí)紫錐菊提取物中菊苣酸含量相比于其他成分要高，其次是綠原酸和咖啡酸，說明這3種成分是紫錐菊提取物中主要的酚酸類成分?？偟膩碚f，紫錐菊提取物中總酚酸及指標(biāo)性成分菊苣酸、綠原酸和咖啡酸的含量因產(chǎn)地不同而不同，初步推測(cè)是由于藥材的生長(zhǎng)環(huán)境，采摘、干燥和貯存等環(huán)節(jié)中存在差異造成的?！睹绹?guó)藥典》中采用標(biāo)準(zhǔn)提取物定性，對(duì)綠原酸對(duì)照品及一測(cè)多評(píng)校正因子進(jìn)行定量，加和，計(jì)算總酚酸含量，三者總含量不少于4%。本研究采用直接測(cè)定法測(cè)定7種酚酸類成分的含量，15個(gè)產(chǎn)地酚酸總含量均未達(dá)到4%，最高僅約為1%。初步分析其原因可能有：一是引種地與原產(chǎn)地的自然條件存在差異，可能造成酚酸類成分含量變化；二是采摘時(shí)期、貯存場(chǎng)所、干燥方式等藥材處理不規(guī)范造成酚酸類成分的降解；三是在紫錐菊引種馴化過程中生物學(xué)因素，如遺傳特性等改變也會(huì)造成體內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化。

表3 不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分的含量測(cè)定結(jié)果

1.安徽；2.江蘇；3.湖北；4.云南；5.河南；6.甘肅；7.湖南；8.四川；9.山西；10.廣西；11.北京；12.河北；13.新疆；14.陜西；15.山東。

圖2 15個(gè)產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分含量聚類分析樹狀圖

1.Anhui；2.Jiangsu；3.Hubei；4.Yunnan；5.Henan；6.Gansu；7.Hunan；8.Sichuan；9.Shanxi；10.Guangxi；11.Beijing；12.Hebei；13.Xinjiang；14.Shaanxi；15.Shandong.

Fig.2 Tree diagram of clustering analysis on the contents of seven phenolic acids in Echinacea extracts from 15 habitats

因不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中酚酸類成分的含量數(shù)據(jù)比較分散，對(duì)其相似程度進(jìn)行直觀比較，很難做出相應(yīng)的結(jié)論。為獲得準(zhǔn)確的結(jié)論，本研究利用化學(xué)識(shí)別模式中的聚類分析方法對(duì)分散的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，按紫錐菊藥材產(chǎn)地進(jìn)行分類歸納。由圖2可知，紫錐菊提取物中酚酸類成分含量的聚類顯示出一定的地域相關(guān)性，根據(jù)樣本層次聚類分析結(jié)果大體上可以分為兩類：樣本湖北、湖南、安徽、江蘇是一類，剩余樣本為一類，表明相鄰省份提取物含量相近。聚類分析結(jié)果可為紫錐菊藥材質(zhì)量的一致性和合理種植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。