FoxO1和p21介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化對七氟烷減輕術(shù)后認(rèn)知功能障礙的促進(jìn)作用*

王占凱，臧穎鴿，張虹

(1.河南省省立醫(yī)院疼痛科，鄭州 451162；2.河南省漯河市臨潁縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，漯河 462600；3.河南省洛陽正骨醫(yī)院藥劑科，洛陽 471000)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive impairment，POCD)是老年患者常見的術(shù)后并發(fā)癥[1]，影響患者的預(yù)后[2]。炎癥是機(jī)體血管系統(tǒng)對損傷因子的防御反應(yīng)，也是機(jī)體對刺激的防御反應(yīng)[3]。炎癥可以是由感染引起的感染性炎癥，也可以是非感染性炎癥。在炎癥發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞。炎癥后巨噬細(xì)胞活化，迅速到達(dá)炎癥部位。它們參與病原體的吞噬，分泌各種細(xì)胞因子和炎癥遞質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥和免疫自我穩(wěn)定[4]。人類有4個FoxO同源基因，分別是FoxO1、FoxO3a、FoxO4和FoxO6。FoxO1是Fox轉(zhuǎn)錄家族的重要成員[5]，廣泛分布于人體各組織和細(xì)胞中。巨噬細(xì)胞分為M1型和M2型[6]。M1型巨噬細(xì)胞具有誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)的高表達(dá)，其特點(diǎn)是促進(jìn)炎癥反應(yīng)，參與積極的免疫調(diào)節(jié)。它們被認(rèn)為在致病微生物的吞噬和促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。M2巨噬細(xì)胞高表達(dá)精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，可下調(diào)免疫應(yīng)答，其主要表現(xiàn)為抗炎、吞噬病原微生物能力減弱，在組織修復(fù)和對寄生蟲的體液細(xì)胞免疫中發(fā)揮作用[8]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性SD大鼠，18 個月齡，體質(zhì)量(400±20) g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2003-0003。大鼠飼養(yǎng)于室溫(22±2)℃，相對濕度(55±5)%的動物房，12 h光/12 h暗循環(huán)下，自由進(jìn)食，飲水。

1.2試劑 戊巴比妥鈉注射液(北京嵐泰化工科技有限公司，批號：80402)；青霉素注射液(廣東殷健藥業(yè)有限公司，批號：1001142)；七氟烷(美國雅培公司，批號：7928)。

1.3儀器 Morris水迷宮(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)；流式細(xì)胞儀(德國貝克曼庫爾特公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒(艾美捷科技有限公司)；小鼠抗大鼠FoxO1單克隆抗體(美國Sigma公司)、兔抗大鼠p21多克隆抗體(美國Sigma公司)；全波長酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；蛋白電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4動物分組與處理 將120 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成對照組、手術(shù)組、麻醉組，每組40只。對照組：大鼠僅腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，無其他手術(shù)操作。手術(shù)組：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉后，行剖腹手術(shù)。皮膚制備消毒后，大鼠腹中切口，用鑷子鈍性分離腹肌，暴露腹膜，解剖切開腹膜，暴露腹腔。用探針對大鼠的肝、脾、胃、小腸和大腸進(jìn)行依次探查，手術(shù)持續(xù)30 min。手術(shù)后縫合創(chuàng)面，傷口覆蓋透氣防水膜，術(shù)后腹腔注射青霉素預(yù)防感染。麻醉組：大鼠置于有機(jī)玻璃麻醉箱內(nèi)，吸入端與七氟烷揮發(fā)罐連接，純氧作為載體氣體，出口端與麻醉氣體監(jiān)測儀連接，維持麻醉箱內(nèi)七氟烷濃度在2.4%，為了吸收二氧化碳，在麻醉箱的底部放置少量的石灰鈉，30 min后，吸入空氣。吸入30 min后，給予手術(shù)組同樣操作處理。無菌條件下，對各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行分離提取，且于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。

1.5水迷宮實(shí)驗(yàn) 每組隨機(jī)選取大鼠10只，分別在術(shù)前30 min，手術(shù)后第1，3，5，7天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。先進(jìn)行定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)，大鼠面對池塘壁，從不同象限進(jìn)入池塘，大鼠從入水到尋找平臺所需的時間即逃離潛伏期。每個實(shí)驗(yàn)被限制在60 s內(nèi)。如果在60 s內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)平臺，則引導(dǎo)大鼠在平臺上停留15 s，時間記錄為60 s。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行4 d訓(xùn)練，每天2次測試，2次平均時間計(jì)為逃避潛伏期。空間探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練1 d后，取出平臺，將大鼠從池壁相同的象限放入池中。記錄原始平臺象限的停留時間和穿越原始平臺的次數(shù)。

1.6海馬內(nèi)容物含量的測定 于術(shù)前30 min，術(shù)后第1，7天，隨機(jī)選擇10只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg·kg-1。取海馬組織，以流式細(xì)胞術(shù)檢測海馬神經(jīng)元凋亡率、細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度([Ca2+]i)。

1.7炎性因子的檢測 取大鼠血清，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測血液中TNF-α、IL-1β、 IL-6因子的表達(dá)水平。利用總RNA快速提取試劑盒提取總RNA，并使用miRNA特有的逆轉(zhuǎn)錄引物，將其與Super M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系：5×PrimeScript 緩沖液4 μL，1×PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，50 μmol·L-1Oligo dT Primer 1 μL(25 pmol)，100 μmol·L-1Random 6 mers 1 μL(50 pmol)，總RNA 1 μL，RNase Free dH2O 12 μL。RT-PCR是在實(shí)時定量系統(tǒng)中上進(jìn)行，擴(kuò)增條件：預(yù)變性，95 ℃ 10 min，變性94 ℃30 s，退火/延伸60 ℃1 min，進(jìn)行40個循環(huán)。溶解曲線：95 ℃15 s，60 ℃1 min，94 ℃15 s，60 ℃15 s引物設(shè)計(jì)見表1，反應(yīng)體系按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8Western blotting測定 取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞調(diào)細(xì)胞濃度至每孔2×106個，接種于96孔板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞，利用Western blotting法檢測大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中FoxO1、p21蛋白的表達(dá)量。選用4%～10%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后將凝膠轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在室溫下用5%脫脂干乳封閉1 h后，首先用1：500稀釋一抗(FoxO1、p21)孵育過夜，TBST緩沖液清洗，加入二抗孵育l h，以TBST溶液漂洗，在暗室將PVDF膜放入ECL顯影液中，放在X光片下曝光顯影。蛋白條帶密度的定量分析采用Image1.6軟件進(jìn)行分析。

表1 引物設(shè)計(jì)表

1.9ELISA法對M1、M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)的測定 在顯微鏡下觀察細(xì)胞充滿后，用胰蛋白酶500 μL消化，放置3 min。通過計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板制作細(xì)胞懸液并接種于96孔板中。用過夜培養(yǎng)法檢測上清液中IL-10、Arg-1、iNOS等細(xì)胞因子的含量，酶標(biāo)法檢測在450 nm波長處吸光度(A值)。以各細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品A450為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度(C)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的計(jì)算公式。計(jì)算待測樣品的濃度，即細(xì)胞因子的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1水迷宮實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果 與術(shù)前30 min比較，手術(shù)組術(shù)后各時間點(diǎn)逃逸潛伏期延長，平臺象限停留時間縮短，穿越原平臺的次數(shù)減少；麻醉組術(shù)后第1，3，5，7天潛伏期延長，縮短平臺象限停留時間，減少穿越原平臺的次數(shù)。結(jié)果見表2～3。

2.2海馬組織內(nèi)容物測定結(jié)果 術(shù)后第1，第7天檢測海馬神經(jīng)元凋亡率和細(xì)胞質(zhì)鈣濃度([Ca2+]i)，術(shù)后第1天海馬神經(jīng)元凋亡率增加，術(shù)后第7天海馬神經(jīng)元凋亡率降低，與對照組比較，手術(shù)組海馬神經(jīng)元凋亡率變化顯著(P<0.05)；與手術(shù)組比較，麻醉組海馬神經(jīng)元凋亡率均小于手術(shù)組，高于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與手術(shù)前30 min比較，手術(shù)組與麻醉組海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]i濃度在第1、第7天時均出現(xiàn)升高降低的趨勢。術(shù)后第1天海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]i濃度增加，術(shù)后第7天海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]i濃度降低，與對照組比較，手術(shù)組海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[[Ca2+]i濃度變化顯著(P<0.05)；與手術(shù)組比較，麻醉組海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]i濃度均小于手術(shù)組，高于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表5。

2.3血液中炎性因子檢測結(jié)果 與對照組比較，手術(shù)組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，麻醉組均高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與手術(shù)組比較，麻醉組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見表6。

2.4FoxO1、p21蛋白表達(dá)量的測定 收集巨噬細(xì)胞，提取總蛋白，通過 Western blotting 對細(xì)胞內(nèi) FoxO1、p21 蛋白的相對表達(dá)量進(jìn)行測定。結(jié)果表明：與對照組比較，手術(shù)組中FoxO1、p21蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，麻醉組中FoxO1、p21蛋白表達(dá)量下降但不顯著(P>0.05)，與手術(shù)組比較，麻醉組FoxO1、p21蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。見圖1，表7。

表2 3組大鼠逃避潛伏期測定結(jié)果

組別術(shù)前30 min術(shù)后第1天術(shù)后第3天術(shù)后第5天術(shù)后第7天對照組23.4±1.324.6±2.125.9±1.124.7±1.625.1±2.1手術(shù)組24.4±2.366.3±1.257.9±2.443.1±1.433.5±1.7麻醉組23.3±1.044.3±2.532.6±2.430.9±1.925.4±2.2F3.49839.04549.59229.49359.042P>0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

表3 3組大鼠原平臺象限停留時間測定結(jié)果

組別術(shù)前30 min術(shù)后第1天術(shù)后第3天術(shù)后第5天術(shù)后第7天對照組50±253±354±255±456±6手術(shù)組53±420±122±230±336±4麻醉組56±334±336±245±156±4F8.04949.85058.94069.03949.029P>0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

表4 3組大鼠穿越平臺次數(shù)測定結(jié)果

Tab.4 Results of times of crossing the original platform in three groups of rats 次，

表5 3組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率和神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]測定結(jié)果

組別海馬神經(jīng)元凋亡率/%術(shù)前30 min術(shù)后第1天術(shù)后第7天海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]術(shù)前30 min術(shù)后第1天術(shù)后第7天對照組3.5±1.04.2±1.13.8±2.14.6±1.15.2±1.35.0±1.4手術(shù)組4.0±1.018.1±2.27.5±2.34.7±2.118.9±3.29.6±2.4麻醉組3.7±1.19.6±2.04.2±1.65.0±1.110.4±2.04.3±1.2F6.02948.94059.0246.02898.03449.056P>0.05<0.05<0.05>0.05<0.05<0.05

表6 3組大鼠血液中免疫因子測定結(jié)果

Tab.6 Determination result of immune factors of blood in three groups of rats

組別TNF-αIL-1βIL-6對照組47.49±9.0236.23±6.0130.49±3.20手術(shù)組90.20±10.0181.04±9.0286.72±8.02麻醉組50.20±3.9138.12±5.0236.92±4.02F49.04549.0383.034P<0.05<0.05>0.05

圖1 Western blotting分析FoxO1和p21蛋白結(jié)果

Fig.1 Analysis result of FoxO1 and p21 protein in three groups by Western blotting

表7 3組巨噬細(xì)胞內(nèi)的FoxO1、p21蛋白表達(dá)量的測定結(jié)果

組別FoxO1p21對照組0.49±0.020.93±0.11手術(shù)組0.20±0.010.44±0.12麻醉組0.38±0.010.72±0.12F49.03659.033P<0.05<0.05

2.5腹腔巨噬細(xì)胞M1、M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)量的測定 通過qRT-PCR對M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、Arg-1表達(dá)量進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，手術(shù)組中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、Arg-1 mRNA表達(dá)量顯著增高(P<0.05)，而麻醉組M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、Arg-1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

3 討論

POCD常見于老年人全身麻醉后，主要表現(xiàn)為躁動不安、精神障礙、譫妄、時空惡化等[9]，影響其預(yù)后。其致病因素可能包括：老年、高血壓、糖尿病、手術(shù)麻醉等[10]，至今尚無有效的預(yù)防措施。腦內(nèi)海馬神經(jīng)元作為學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)神經(jīng)元，在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等方面與POCD有著密切的關(guān)系[11-12]。

研究表明，七氟烷預(yù)處理可以減輕各種因素對海馬神經(jīng)元的損傷[13-14]。本研究通過水迷宮實(shí)驗(yàn)對七氟烷干預(yù)后大鼠認(rèn)知功能進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)，與術(shù)前30 min比較，手術(shù)組術(shù)后各時間點(diǎn)逃逸潛伏期延長，平臺象限停留時間縮短，穿越原平臺的次數(shù)減少；麻醉組術(shù)后第1，3，5，7天潛伏期延長，縮短平臺象限停留時間，減少穿越原平臺的次數(shù)。由流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第1，第7天檢測海馬神經(jīng)元凋亡率和胞質(zhì)鈣濃度([Ca2+])，術(shù)后第1天海馬神經(jīng)元凋亡率增加，術(shù)后第7天海馬神經(jīng)元凋亡率降低，與對照組比較，手術(shù)組海馬神經(jīng)元凋亡率變化顯著(P<0.05)；與手術(shù)組比較，麻醉組海馬神經(jīng)元凋亡率均減小，且高于對照組。與手術(shù)前30 min比較，手術(shù)組與麻醉組海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]濃度在第1，第7天時均出現(xiàn)升高降低的趨勢。術(shù)后第1天海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]濃度增加，術(shù)后第7天海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]濃度降低，與對照組比較，手術(shù)組海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]濃度變化顯著；與手術(shù)組比較，麻醉組海馬神經(jīng)元胞質(zhì)[Ca2+]濃度均減少，且高于對照組。

FoxO具有多種絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)[15-16]。在無興奮劑的情況下，F(xiàn)oxO被脫磷并位于細(xì)胞核中。在生長因子或血清刺激條件下，PI3K/PKB信號通路調(diào)節(jié)FoxO的絲氨酸、蘇氨酸和賴氨酸殘基的磷酸化修飾，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后激活狀態(tài)發(fā)生改變[17-18]。HUO等[19]研究結(jié)果表明，F(xiàn)oxo1轉(zhuǎn)錄因子在膽汁淤積性肝纖維化肝組織炎癥中的表達(dá)較低，同樣有報道指出Foxo1轉(zhuǎn)錄因子參與氧化應(yīng)激等過程。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，麻醉組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與手術(shù)組比較，麻醉組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平均降低(P<0.05)。與對照組比較，手術(shù)組中FoxO1、p21蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，麻醉組中FoxO1、p21蛋白表達(dá)量下降但不顯著(P>0.05)。

巨噬細(xì)胞可分為兩種亞型：經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞M1和交替活化的巨噬細(xì)胞M2。隨著炎癥的發(fā)展，M1型巨噬細(xì)胞逐漸減少，而M2型巨噬細(xì)胞逐漸增多。在炎癥早期，M1型巨噬細(xì)胞的增加有利于清除病原微生物，促進(jìn)炎癥的進(jìn)展。然而，隨著炎癥的進(jìn)一步發(fā)展，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多。一旦占主導(dǎo)地位，它們可以延遲或抑制炎癥反應(yīng)和修復(fù)受損部位。研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化的晚期，患者血漿中含有Th2型細(xì)胞因子，它能激活M2型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)纖維帽的形成，從而增加斑塊的穩(wěn)定性。DEVARAJ等[20]發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞與CRP孵育7 d，單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α、MCP-1和IL-1顯著增加，表明CRP可誘導(dǎo)單核細(xì)胞向M1型細(xì)胞分化，也可逆轉(zhuǎn)M2型細(xì)胞向M1型細(xì)胞分化。本研究通過qRT-PCR對M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、Arg-1表達(dá)量進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，麻醉組M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、Arg-1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。