普萘洛爾抑制前列腺癌發(fā)展的分子機(jī)制

王仕欽，江春，黃衛(wèi)，黃輝虎

(1.海南省中醫(yī)院外二科，?？?570203；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院泌尿外科，廣州 510120)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康[1]。目前前列腺癌常用化學(xué)治療(化療)藥物有多柔比星[2]和紫杉醇[3]等，但患者對現(xiàn)有化療藥物產(chǎn)生的耐藥性嚴(yán)重限制化療的療效，因此亟待尋找針對前列腺癌新的化療藥物。普萘洛爾(propranolol)是一種治療心律失常的藥物，近年來發(fā)現(xiàn)普萘洛爾也能夠?qū)π律鷥貉芰鯷4]、前列腺癌[5]、新生兒面部橫紋肌瘤[6]和乳腺癌[7]等癌癥具有一定效果。BROHEE等[8]發(fā)現(xiàn)普萘洛爾能夠通過控制糖代謝抑制前列腺癌的發(fā)展，除此之外，普萘洛爾也能夠明顯降低前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[9]，但目前尚不明確其具體機(jī)制。小分子核糖核苷酸(microRNA，miRNA)是一類長約22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在腫瘤發(fā)病過程中具有重要作用[10]，是一種治療腫瘤的理想藥物[11]。LU等[10]報(bào)道普萘洛爾能夠靶向下調(diào)miR-1的表達(dá)水平。miR-382是一種抑癌因子，對食管鱗狀細(xì)胞癌[12]、前列腺癌[13]和非小細(xì)胞肺癌[14]等癌癥的發(fā)展具有調(diào)控作用。此外，普萘洛爾能夠上調(diào)新生兒血管瘤細(xì)胞內(nèi)miR-382的表達(dá)水平，抑制新生兒血管瘤細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[15]，同時(shí)，miR-382對PC細(xì)胞的增殖和遷移能力具有抑制作用[13]。SETD8是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠使p53信號通路失活[16]。CHEN等[14]報(bào)道m(xù)iR-382能夠通過靶向下調(diào)SETD8的表達(dá)，抑制非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)生。VESCHI等[17]報(bào)道SETD8能夠通過p53信號通路，促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的凋亡。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-382和SETD8在前列腺癌組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，并且普萘洛爾對其表達(dá)水平具有調(diào)控作用。筆者通過研究，推測普萘洛爾通過miR-382/SETD8/p53分子軸抑制前列腺癌的發(fā)展，為臨床治療前列腺癌提供新的思路。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取2017年1—5月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)前列腺癌患者18例，TNM 分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期12例。年齡45～78歲，平均年齡(56.3±5.4)歲。留取其前列腺癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。所有患者術(shù)前均未接受放化療，均簽署知情同意書。

1.2細(xì)胞系 人前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP和PC3)和人源胚胎腎細(xì)胞(HEK-293T)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RWPE-1細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫，分別用標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，待密度達(dá)80%時(shí)，收集細(xì)胞備用。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 雄性NIH小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2018-0002，飼養(yǎng)于無特定病原體(SPF)級實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境中。

1.4主要試劑 胎牛血清(批號：16000-044，Gibco，San Diego，CA，USA)，DMEM培養(yǎng)液(批號：C11885500BT，Gibco，San Diego，CA，USA)，0.25%胰酶(批號：25200056，Thermo Fisher Scientific，USA)，TRIzol試劑(批號：15596026，Invitrogen，USA)，LipofectaminTM2000(批號：11660-027，Invitrogen，USA)。熒光基因報(bào)告載體pGL3-Luciferase Reporter由Ambion公司設(shè)計(jì)并合成，內(nèi)參載體pRL-TK和雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑(批號：E1910，Promega Corporation，USA)均購自Promega公司，兔抗人SETD8(批號：ab3798)、N-鈣黏蛋白(N-cad，批號：ab18203)、E-鈣黏蛋白(E-cad，批號：ab1416)、波形蛋白(Vimentin，批號：ab193555)、Bcl-2(批號：ab185002)、Bax(批號：ab32503)、Caspase 9(批號：ab219590)、p53(批號：ab32389)和p21(批號：ab218311) 抗體均購自美國Abcam公司；miR-382Mimic、miR-382 inhibitor和miR-382 control由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成，CCK-8細(xì)胞增殖及毒性試劑盒(批號：CA1210，Solarbio)。

1.5儀器 多功能酶標(biāo)儀(SynergyTM2)購自BioTek公司，熒光定量PCR儀(Light-Cycler 480Ⅱ)購自Roche公司，化學(xué)發(fā)光儀(BDMAX)購自BD公司，Olympus1×51倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.6qRT-PCR檢測前列腺癌和癌旁組織中miR-382和SETD8 mRNA的表達(dá) 患者前列腺癌和癌旁組織標(biāo)本各取約100 mg，加入1 mL Trizol，用PRO-200組織勻漿機(jī)(Pro Scientific，USA)充分破碎后，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。抽提總RNA測定濃度及純度后，設(shè)計(jì)并合成miR-382逆轉(zhuǎn)錄引物：正向5′-ACACTCCAGCTGGGGAAGTTGTTCGTGGTG-3′，反向：5′-CGAATC CCTCAACTGGTGC-3′。SETD8 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物為：正向5′-TCAGGCCTCA AAGCCACCTGAT-3′，反向5′-TAGGCCATCCAACC-TGCATTACCG-3′。U6的逆轉(zhuǎn)錄引物為：正向 5′-CTCGCTTCGCAGCACA-3′，反向 3′-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。以?actin作為內(nèi)參，qRT-PCR引物見表1。用ABI PRISM 7500型熒光定量PCR擴(kuò)增儀(Thermo fisher Scientific，USA)檢測miR-382和SETD8 mRNA表達(dá)水平，Real-Time PCR反應(yīng)體系及條件：2×SYBR Premix 10 μL，ddH2O 0.8 μL，cDNA1 μL，PCR上游和下游引物各0.5 μL，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。將miR-382和SETD8 mRNA表達(dá)量分別與內(nèi)參U6和β-actin表達(dá)量的比值作為其相對表達(dá)水平，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 qPCR引物序列

1.7Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平 根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書提取組織或細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠電泳分離目的蛋白，濕轉(zhuǎn)法將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，浸入5%脫脂奶粉中，搖床上室溫封閉2 h。洗膜后加入一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗兔二抗(1：10 000)，室溫振蕩孵育1 h。按照A液：B液(1：1)配制電致化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液，混勻放置1 min后均勻加在膜正面。利用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)觀察蛋白條帶，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8CCK-8檢測前列腺癌細(xì)胞增殖能力 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)將0.01 mg·mL-1普萘洛爾與PC細(xì)胞系LNCaP和PC3在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)條件下共培養(yǎng)0，12，24，36和48 h，向每孔加入CCK-8液10 μL，繼續(xù)孵育4 h后進(jìn)行檢測。SynergyTM2多功能酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測各孔吸光度值(A值)，以A值代表細(xì)胞相對增殖水平，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.9小鼠動物模型的構(gòu)建 將前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC3在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，待單細(xì)胞生長密度達(dá)到60%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105·mL-1，每只NIH小鼠皮下注射200 μL，共30只小鼠，在相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)10～14 d，建立前列腺癌動物模型。向每只小鼠腫瘤原位注射0.01 mg·mL-1普萘洛爾和磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μL，分為對照組(PBS)、普萘洛爾組，普萘洛爾+miR-382抑制劑組，每日觀察小鼠，并記錄小鼠死亡時(shí)間。

1.10瞬時(shí)超表達(dá)/敲降miR-382前列腺癌細(xì)胞系的構(gòu)建 將處于對數(shù)生長期LNCaP和PC3細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔細(xì)胞2×106個(gè)，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為轉(zhuǎn)染試劑對照組、陰性對照組(NC)、miR-382 Mimic組和miR-382 Inhibitor組，miR-382 Mimic和Inhibitor終濃度為80 nmol·L-1。按照說明書將各組轉(zhuǎn)染物與LipofectamineTM2000混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h之后，采用qRT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染是否成功。

1.11雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測miR-382轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后SETD8 3’-UTR的報(bào)告基因活性 生物信息學(xué)方法預(yù)測SETD8基因上miR-382靶向位點(diǎn)，以PC3細(xì)胞的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出野生型SETD8 3’-UTR序列，并以3’-UTR野生型載體為模板構(gòu)建突變型SETD8(mu)3’-UTR報(bào)告載體。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對照組(轉(zhuǎn)染報(bào)告載體pGL3-Luciferase空載體、內(nèi)參載體pRL-TK和Ctrl-Mimic)；陰性對照組(轉(zhuǎn)染報(bào)告載體pGL3-Luciferase空載體、內(nèi)參載體pRL-TK和miR-382 Mimic)；實(shí)驗(yàn)組[轉(zhuǎn)染SETD8 3’-UTR或SETD8(mu)3’-UTR報(bào)告載體、內(nèi)參載體pRL-TK和Ctrl-Mimic或miR-382 Mimic]。將293T細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種至96孔板，每孔3 000個(gè)細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞密度達(dá)到約50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照說明書將各組轉(zhuǎn)染物與LipofectamineTM2000混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后加入PLB裂解液室溫裂解15 min，采用雙熒光素酶報(bào)告基因法上機(jī)檢測，以Firefly與TK Renilla熒光活性的比值作為報(bào)告基因活性值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.12Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測前列腺癌細(xì)胞遷移能力 Transwell小室內(nèi)膜預(yù)先用Matrigel膠包被，實(shí)驗(yàn)開始前向每個(gè)小室內(nèi)加入含10 g·L-1BSA的無血清培養(yǎng)基50 μL，37 ℃孵育30 min，水化基底膜。分別將LNCaP和PC3細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù)，分為對照組、超表達(dá)miR-382組(miR-382 Mimic)和同時(shí)超表達(dá)miR-382和SETD8組(382-Mimic+SETD8)，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105·mL-1，向上層小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μL，小室下層加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基400 μL。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，使用棉簽輕輕拭去微孔膜上層的細(xì)胞。4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS洗2次，結(jié)晶紫染色30 min后，再用PBS洗2次。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移至微孔膜下層的細(xì)胞(選取5個(gè)視野)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1miR-382和SETD8 mRNA在前列腺癌組織和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異 Real-Time qPCR檢測結(jié)果表明，miR-382在前列腺癌組織內(nèi)的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織[(0.398±0.012)比(0.882±0.023)，P=0.031]，而SETD8在前列腺癌組織內(nèi)的表達(dá)水平則明顯高于癌旁正常組織[(2.83±0.141)比(1.526±0.083)，P=0.002]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。與人正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1比較，miR-382在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC3內(nèi)的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P=0.003，0.001)，而SETD8的表達(dá)水平則明顯上調(diào)(P=0.014，0.008)。表明miR-382在前列腺癌組織和細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)，而SETD8高表達(dá)，兩者表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

2.2普萘洛爾調(diào)控前列腺癌細(xì)胞內(nèi)miR-382、SETD8和p53的表達(dá) Real-Time qPCR結(jié)果見圖2，與對照組(0 h)比較，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，普萘洛爾明顯提高miR-382在PC細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)水平(P<0.01)，抑制SETD8 mRNA的表達(dá)(P<0.01或P<0.05)。Western blotting結(jié)果見圖3。與對照組(0 h)相比，共培養(yǎng)12，24，36和48 h后，普萘洛爾能夠明顯降低前列腺癌細(xì)胞系內(nèi)SETD8蛋白的表達(dá)水平(P=0.005，0.003，0.002，0.012)，并提高p53蛋白的表達(dá)水平(P=0.043，0.021，0.008，0.004)。表明普萘洛爾能夠上調(diào)前列腺細(xì)胞系內(nèi)miR-382和p53的表達(dá)水平，抑制SETD8的表達(dá)，并且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，普萘洛爾的作用越明顯。

①與正常組織比較，P<0.01。

①Compared with normal tissue，P<0.01.

2.3前列腺癌細(xì)胞增殖抑制結(jié)果 將普萘洛爾與前列腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)12，24，36和48 h，CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力結(jié)果見圖4。與對照組比較，共培養(yǎng)48 h，普萘洛爾能夠明顯抑制兩株前列腺癌細(xì)胞的增殖能力(P=0.053，0.048)，共培養(yǎng)時(shí)間越長，效果越明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與普萘洛爾單獨(dú)組比較，普萘洛爾和miR-382抑制劑同時(shí)共培養(yǎng)能夠使前列腺癌細(xì)胞的增殖能力得到部分恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015，0.017)。分別采用前列腺癌細(xì)胞系建立小鼠腫瘤模型，與對照組比較，腫瘤內(nèi)單獨(dú)注射普萘洛爾能夠明顯延長小鼠的存活時(shí)間(P=0.025，0.013)，同時(shí)注射miR-382抑制劑則部分延長小鼠的存活時(shí)間(P=0.036，0.032)(圖5)。以上結(jié)果表明，普萘洛爾通過miR-382抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。

①與0 h比較，P<0.05。

①Compared with 0 h，P<0.05.

2.4miR-382通過SETD8調(diào)控p53/p21信號通路 Western blotting結(jié)果見圖6，與對照組比較，miR-382 Mimic能夠明顯降低前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC3內(nèi)SETD8的表達(dá)水平[(0.286±0.016)和(0.493±0.028)比(0.963±0.083)和(1.112±0.321)，P=0.008，0.013]，而miR-382抑制劑對SETD8表達(dá)水平無明顯影響[(0.963±0.083)和(1.112±0.321)比(1.064±0.201)和(1.031±0.032)，P=0.241，0.883]。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示(圖7)，miR-382能夠靶向抑制SETD8的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步探究miR-382是否通過SETD8調(diào)控p53信號通路，在前列腺癌細(xì)胞系內(nèi)超表達(dá)SETD8或采用miR-382 Mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blotting結(jié)果表明(圖8)，與對照組比較，超表達(dá)SETD8能夠明顯降低前列腺癌細(xì)胞系內(nèi)p53和p21的表達(dá)水平(P=0.008，0.024；P=0.013，0.041)，miR-382 Mimic明顯提高p53和p21的表達(dá)水平(P=0.001 2，0.006 3；P=0.004，0.021)?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú)超表達(dá)SETD8組比較，同時(shí)采用miR-382 Mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠回復(fù)p53和p21的表達(dá)水平(P=0.013，0.037；P=0.043，0.008)。以上結(jié)果提示，miR-382通過靶向調(diào)控SETD8，提高p53信號通路的活性。

圖5 3組小鼠存活時(shí)間

①與對照組比較，P<0.01。

圖6 Western blotting法檢測前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC3內(nèi)SETD8表達(dá)水平

①Compared with control group，P<0.01.

Fig.6 The expression levels of SETD8 in prostate cancer LNcaP and PC3 cells detected by Western blotting

①與SETD8-Mut3'UTR比較，P<0.01。

圖7 3組基因檢測結(jié)果雙熒光素酶報(bào)告基因

①Compared with SETD8-Mut3'UTR，P<0.01.

Fig.7 Results of dual-luciferase report gene for three groups

①與對照組比較，P<0.01。

圖8 超表達(dá)SETD8對前列腺癌細(xì)胞系內(nèi)p53和p21表達(dá)水平的影響

①Compared with control group，P<0.01.

Fig.8 Effect of overexpressed SETD8 on the expression of p53 and p21 in prostate cancer cells

2.5miR-382/SETD8分子軸調(diào)控前列腺癌細(xì)胞凋亡 由于p53信號通路與細(xì)胞凋亡相關(guān)，因此推測miR-382/SETD8分子軸能夠調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的凋亡。Western blotting結(jié)果表明(圖9)，與對照組比較，超表達(dá)SETD8能夠明顯提高前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP和PC3)內(nèi)凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)水平(P=0.001，0.006 8)，抑制凋亡促進(jìn)因子Bax(P=0.009，P=0.012)和Caspase 9(P=0.042，0.036)的表達(dá)。而轉(zhuǎn)染miR-382 Mimic則能夠明顯提高細(xì)胞內(nèi)Bax(P=0.026，0.015)和Caspase 9(P=0.049，0.019)的表達(dá)水平，降低Bcl-2的表達(dá)水平(P=0.025，0.008)?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú)超表達(dá)SETD8組比較，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-382 Mimic能夠抑制Bcl-2的表達(dá)(P=0.039，0.043)，并促進(jìn)Bax(P=0.012，0.006)和Caspase 9(P=0.021，0.043)的表達(dá)。表明miR-382能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而SETD8能夠抑制細(xì)胞凋亡。該結(jié)果提示，miR-382可能通過SETD8促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。

①與對照組比較，P<0.01。

圖9 Western blotting法檢測miR-382/SETD8分子軸調(diào)控細(xì)胞凋亡結(jié)果

①Compared with control group，P<0.01.

Fig.9 Regulation of miR-382/SETD8 axis on apoptosis detected by western blotting

2.6miR-382通過SETD8調(diào)控前列腺癌細(xì)胞遷移 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10，與對照組比較，miR-382 Mimic能夠明顯降低前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的遷移能力[(334.4±38.18)和(176.8±19.56)比(129.8±16.65)和(50.6±11.36)，均P<0.01]。但是與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-382 Mimic組相比，同時(shí)超表達(dá)SETD8并轉(zhuǎn)染miR-382則能夠提高細(xì)胞的遷移能力[(129.8±16.65)和(50.6±11.36)比(214.8±31.35)和(81.8±10.65)，均P<0.01]。Western blotting結(jié)果見圖11。與對照組比較，超表達(dá)SETD8能夠提高前列腺癌細(xì)胞內(nèi)N-cad(P=0.008，0.004 3)和Vimentin(P=0.015，0.035)的表達(dá)水平，并抑制E-cad的表達(dá)(P=0.003，0.001)。轉(zhuǎn)染miR-382 Mimic能夠抑制N-cad(P=0.001，0.004)和Vimentin(P=0.029，0.018)的表達(dá)，提高E-cad的表達(dá)水平(P=0.023，0.031)。與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-382 Mimic組比較，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-382 Mimic并超表達(dá)SETD8能夠明顯提高N-cad(P=0.003，0.045)和Vimentin(P=0.008，0.012)的表達(dá)水平，抑制E-cad(P=0.007，0.028)的表達(dá)。以上結(jié)果說明miR-382能夠抑制前列腺癌細(xì)胞遷移，而SETD8則能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移。提示miR-382可能通過調(diào)控SETD8抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移。

①與對照組比較，P<0.01。

圖10 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

①Compared with control group，P<0.01.

Fig.10 Result of cell migration test by transwell

①與對照組比較，P<0.05。

圖11 Western blotting檢測miR-382/SETD8分子軸調(diào)控細(xì)胞遷移結(jié)果

①Compared with control group，P<0.05.

Fig.11 Regulation of miR-382/SETD8 axis on cell migration detected by western blotting

3 討論

前列腺癌嚴(yán)重危害男性健康，目前患者已對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重限制化療的療效[19]。普萘洛爾是一種治療心律失常的藥物，目前已被應(yīng)用于多種癌癥的治療[20]，本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)普萘洛爾能夠抑制前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但目前尚不清楚其具體機(jī)制。

miRNAs已被報(bào)道參與癌癥的發(fā)生，但筆者目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道普萘洛爾通過miRNAs抑制前列腺癌。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，抑癌因子miR-382在前列腺癌組織和細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)，并且超表達(dá)miR-382能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與ZGANG等[13]研究結(jié)果一致，提示miR-382可能是前列腺癌的潛在治療因子。SETD8能夠促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生[21]，高表達(dá)SETD8能夠通過失活p53/p21信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]。而miR-382能夠靶向下調(diào)SETD8的表達(dá)水平[22]，這與本研究結(jié)果一致，筆者發(fā)現(xiàn)SETD8在前列腺癌組織和細(xì)胞內(nèi)異常高表達(dá)，與miR-382的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，并且p53/p21信號通路處于失活狀態(tài)，提示miR-382/SETD8/p53/p21分子軸可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，但尚不清楚普萘洛爾是否通過調(diào)控miR-382/SETD8/p53/p21分子軸治療前列腺癌。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾能夠明顯提高前列腺癌細(xì)胞內(nèi)miR-382的表達(dá)水平，降低SETD8的表達(dá)并激活p53/p21信號通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，普萘洛爾能夠通過提高前列腺癌細(xì)胞內(nèi)miR-382的表達(dá)水平，miR-382抑制SETD8的表達(dá)，解除SETD8對p53/p21信號通路的抑制作用，激活p32/p21信號通路，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。LI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾能夠抑制嬰兒血管瘤細(xì)胞內(nèi)miR-382的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制其發(fā)展。本研究結(jié)果與之不一致，提示普萘洛爾和miR-382可能對不同癌癥具有不同的效果，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。以上結(jié)果表明，普萘洛爾能夠通過調(diào)控miR-382/SETD8/p53/p21分子軸抑制前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。值得注意的是，有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)p53基因在前列腺癌細(xì)胞系PC3中存在缺失突變[23]，但目前也有文獻(xiàn)證實(shí)p53在PC3細(xì)胞的增殖和凋亡等生命活動中扮演重要角色。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LINP1能夠通過靶向p53，調(diào)控前列腺癌細(xì)胞系p53的增殖能力[24]。除此之外，4-FTSC(4-Fluorobenzaldehyde limonene-based thiosemicarbazone)能夠通過調(diào)控p53蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究證實(shí)普萘洛爾可以作為前列腺癌的潛在治療藥物，并且揭示普萘洛爾通過miR-382/SETD8/p53分子軸抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為前列腺癌的治療提供了新的靶標(biāo)。