山楂葉總黃酮對高脂血癥大鼠血脂的影響及其機制*

刁婷婷，張雨晨，陳創(chuàng)，張朵朵，梅雨，吳一昊，呂偉，閔清

(1.湖北科技學院藥學院，咸寧 437100；2.湖北省咸寧市中心醫(yī)院藥學部，咸寧 437100)

山楂葉為薔薇科植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.major N.E.Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉，《中華人民共和國藥典》2015年版記載山楂葉味酸，性平，歸脾、胃、肝經(jīng)；具有活血化瘀，理氣通脈，化濁降脂的功能，用于氣滯血瘀、胸痹心痛、胸悶憋氣、心悸健忘、眩暈耳鳴、高脂血癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉提取物中主要成分為山楂葉總黃酮(Hawthorn leaves flavonoids，HLF)，包括槲皮素、金絲桃苷、黃酮苷、葒草素、葡荊牡黃酮等多種黃酮類化合物[2]，是一種作用廣泛、不良反應(yīng)較少的天然藥物?，F(xiàn)代研究表明，HLF在心、腦血管，糖尿病及其并發(fā)癥，肝細胞的修復等方面具有很好的藥理作用[3]。

前人在研究HLF調(diào)節(jié)血脂的作用時，在實驗中大多是對動物血液中對應(yīng)指標進行檢測和研究。楊宇杰等[4]研究表明，山楂葉總黃酮可明顯降低高脂血癥模型血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。劉全亮等[5]研究表明，不同純度山楂葉總黃酮均可以降低高脂血癥模型小鼠的TC和TG水平，降低小鼠體質(zhì)量，高純度山楂葉總黃酮優(yōu)于低純度。筆者在前人實驗基礎(chǔ)上，建立高脂血癥動物模型，觀察HLF對高脂血癥大鼠血脂含量和肝臟功能的影響，通過測定肝臟組織中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl carboxylase，ACC)的蛋白表達水平，探討HLF對高脂血癥大鼠調(diào)節(jié)血脂及肝臟的影響及其可能機制，為HLF的進一步開發(fā)提供相關(guān)實驗資料。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量170～220 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001。動物房溫度(22±2)℃，濕度55%～60%，大鼠自由飲水、攝食。高脂飼料(20180604)由北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司提供，主要含蛋白質(zhì)24.2%，碳水化合物42.1%，脂肪25.4%，粗纖維5.5%，鈣1.7%，磷1.1%。基礎(chǔ)飼料由武漢萬千嘉興公司提供，主要含玉米40%，豆粕20%，進口魚粉7%，面粉23%，進口酵母3.5%，復合礦物鹽4%，復合維生素0.2%，復合氨基酸0.8%，油1.5%。

1.2藥品與試劑 山楂葉總黃酮(臨沂愛康藥業(yè)有限公司，批號：AKH16-3，含量為93.5%)；辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司，批準文號：國藥準字J2913068)；TG試劑盒(批號：20180731)、TC試劑盒(批號：20180731)、HDL-C試劑盒(批號：20180817)、LDL-C試劑盒(批號：20180816)、油紅O染液(批號：20180815)均購自南京建成生物工程研究所；ACC抗體(產(chǎn)品編號：AF1867)、p-ACC抗體(產(chǎn)品編號：AA110)、AMPK抗體(產(chǎn)品編號：AF1627)、p-AMPK抗體(產(chǎn)品編號：AF2677)、β-Actin抗體(產(chǎn)品編號：AF0003)均購自碧云天試劑有限公司。

1.3動物分組 將SD雄性大鼠，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組及HLF小、中、大劑量組，每組8只。

1.4造模及給藥 參照文獻[6]的方法，制備高脂血癥大鼠模型，檢測大鼠血漿中TC和TG含量，確定高脂血癥大鼠模型建立是否成功。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，正常對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料，其余各組大鼠給予高脂飼料，造模8周。高脂飼料喂養(yǎng)的同時給予藥物干預。辛伐他汀組給予辛伐他汀4 mg·kg-1，HLF小、中、大劑量組給予HLF，劑量分別為100，200，400 mg·kg-1，正常對照組和模型對照組給予純化水1 mL·(100 g)-1，每天1次，連續(xù)灌胃給藥8周。

1.5生化指標與肝臟指數(shù)測定 末次給藥后禁食不禁水12 h，麻醉，腹主動脈取血，4 ℃，3500 r·min-1離心15 min，收集血漿。處死大鼠，摘取肝臟，稱質(zhì)量并計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)(%)=肝臟濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。取部分肝臟組織制備肝勻漿，待測。按照試劑盒說明書測定大鼠血漿中的TG、TC、HDL-C、LDL-C含量及肝勻漿中TG、TC含量，觀察HLF對高脂血癥大鼠血脂的影響。

1.6蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝臟組織病理學改變 將分離的大鼠肝右葉條形組織塊用4%緩沖多聚甲醛固定48 h后，制作病理切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織病理學變化。

1.7油紅O染色觀察肝臟脂質(zhì)聚集情況 將分離的各組大鼠肝臟組織用4%多聚甲醛緩沖液固定48 h后，放到10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，直至組織沉底。然后用聚乙二醇/聚乙烯醇混合物(OTC)包埋后于-20 ℃條件下進行冷凍切片，按照油紅O染液試劑盒說明書進行染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟脂質(zhì)聚集情況。

1.8Western blotting法分析肝臟AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC蛋白表達 將大鼠肝臟組織塊剪成小塊置于勻漿器，加入裂解液，冰上操作充分勻漿使其裂解完全，4 ℃，12000 r·min-1，離心15 min，收集上清液。BCA法測蛋白濃度，取調(diào)整好蛋白濃度的樣本上樣，按照電泳程序進行電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，洗滌3次，室溫搖動孵育二抗1.5 h，洗滌3次，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1動物一般情況 正常對照組大鼠毛發(fā)光滑，飲食活動正常，體質(zhì)量正常，精神狀態(tài)良好。模型對照組大鼠體質(zhì)量增加量高于正常對照組，實驗前期毛發(fā)粗糙，微黃色，活躍程度下降。各給藥組大鼠生長較正常，體質(zhì)量略有增長，飲食活動較正常，精神狀態(tài)較好。

2.2HLF對高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的影響 結(jié)果見表1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.01)，說明高脂飼料使得肝臟被脂肪浸潤，損傷肝臟，提示高脂血癥大鼠模型成立；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組和辛伐他汀組肝臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，并具有一定的濃度依賴性，說明HLF能夠明顯減輕肝臟的脂肪浸潤，改善肝功能。

表1 6組大鼠肝臟指數(shù)檢測值

組別劑量/(mg·kg-1)肝臟質(zhì)量/g肝臟指數(shù)/%正常對照組-6.3±0.692.01±0.1模型對照組-11.6±1.122.59±0.12①辛伐他汀組810.4±1.202.41±0.19②HLF 小劑量組10010.1±1.102.31±0.21③ 中劑量組2008.9±0.792.27±0.12③ 大劑量組4009.0±0.492.24±0.11③

①與正常對照組比較，t=10.06，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.19，P<0.05；③與模型對照組比較，t=3.18，5.06，6.02，P<0.01。

①Compared with normal control group，t=10.06，P<0.01；②compared with model control group，t=2.19，P<0.05；③compared with model control group，t=3.18，5.06，6.02，P<0.01.

2.3HLF對高脂血癥大鼠血漿血脂的影響 結(jié)果見表2。與正常對照組比較，第8周模型對照組大鼠血漿中TG、TC以及LDL-C含量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明高脂血癥大鼠模型建立成功，HDL-C含量低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義；與模型對照組比較，第8周HLF小劑量組和辛伐他汀組大鼠血漿中TG、TC以及LDL-C含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，并具有一定的濃度依賴性，其中，HLF中、大劑量組大鼠血漿中TG、TC以及LDL-C含量極顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4HLF對高脂血癥大鼠肝臟脂肪含量的影響 結(jié)果顯示，正常對照組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)呈藍色，未見明顯紅色脂滴；與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的紅色脂滴，在切片的視野內(nèi)可以觀察到整個肝臟切面的大面積的脂滴分布；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組和辛伐他汀組大鼠肝細胞紅色脂滴明顯減少，且HLF大劑量組大鼠肝細胞內(nèi)紅色脂滴減少較HLF小、中劑量組更明顯。見圖1。

2.5HLF對高脂血癥大鼠肝臟病理變化的影響 結(jié)果顯示，正常對照組大鼠肝小葉和肝細胞索結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細胞大小均勻，無明顯脂肪變性；與正常對照組比較，模型對照組的大鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)較多大小不等的脂肪滴，部分肝細胞核被脂肪滴擠壓而明顯偏位，脂質(zhì)沉積和肝臟脂肪變性程度較為嚴重；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組和辛伐他汀組肝小葉和肝細胞索結(jié)構(gòu)較為清晰，且肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和肝臟脂肪變性程度明顯減輕。見圖2。

表2 6組大鼠血漿血脂的檢測值

Tab.2 Plasma Lipid of six groups of rats

組別劑量/(mg·kg-1)TGTCHDL-CLDL-C正常對照組-0.65±0.061.48±0.351.24±0.110.50±0.11模型對照組-1.07±0.10①3.80±0.34①1.11±0.201.26±0.03①辛伐他汀組80.64±0.12②2.14±0.32②1.17±0.260.93±0.14②HLF 小劑量組1000.83±0.07②3.23±0.44③1.22±0.241.10±0.07③ 中劑量組2000.81±0.13②2.85±0.46②1.27±0.211.03±0.08② 大劑量組4000.70±0.18②2.65±0.37②1.27±0.150.89±0.06②

①與正常對照組比較，t=10.71，14.15，19.16，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，t=10.71，14.15，19.16，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01；③compared with model control group，P<0.05.

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組；E.HLF中劑量組；F.HLF大劑量組。

A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.low-dose HLF group；E.media-dose HLF group；F.high-dose HLF group.

Fig.1 Oil red O staining of liver tissues in six groups of rats (×400)

A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.low-dose HLF group；E.media-dose HLF group；F.high-dose HLF group.

Fig.2 Image of HE staining on liver tissues in six groups of rats (×400)

2.6HLF對高脂血癥大鼠肝臟AMPK、ACC蛋白表達的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠AMPK蛋白表達顯著性下調(diào)(P<0.01)；與模型對照組比較，HLF小，中，大劑量組及辛伐他汀組AMPK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，模型對照組大鼠p-AMPK/AMPK蛋白表達顯著性下調(diào)(P<0.01)；與模型對照組比較，HLF大劑量組及辛伐他汀組p-AMPK/AMPK蛋白表達顯著性上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，但HLF小、中劑量組表達差異無統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，模型對照組大鼠ACC蛋白表達顯著性上調(diào)(P<0.01)；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組及辛伐他汀組ACC蛋白表達均差異無統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，模型對照組大鼠p-ACC/ACC蛋白表達顯著性上調(diào)(P<0.01)；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組及辛伐他汀組p-ACC/ACC蛋白表達均顯著性下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，其中HLF大劑量組p-ACC/ACC蛋白表達下調(diào)最為明顯。見圖3。

3 討論

高脂血癥是由各種原因?qū)е卵獫{中TC、TG和(或) LDL-C過高或HDL-C過低的一種脂代謝異常性疾病，又被稱為脂質(zhì)異常血癥[7]。近年來，隨著生活水平的提高，人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，高脂血癥已嚴重危害人類的身體健康，長期血脂過高引發(fā)機體代謝紊亂，進而產(chǎn)生動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死等心腦血管疾病，已成為全球人類健康“第一殺手”[8]。

高脂血癥的預防以及治療對降低慢性病特別是由脂質(zhì)代謝異常引起的心血管疾病、肥胖以及糖尿病等是有效的。盡管西藥在調(diào)脂方面一直占據(jù)主導地位，但是高脂血癥患者使用西藥時的不良反應(yīng)以及部分患者的不耐受性，使得人們對中醫(yī)藥治療高脂血癥越來越感興趣。中醫(yī)藥治療高脂血癥的優(yōu)勢在于其價格便宜，效果與西藥藥效相當，且副作用少[9-15]。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組；E.HLF中劑量組；F.HLF大劑量組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與模型對照組比較，P<0.05。

A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.low-dose HLF group；E.media-dose HLF group；F.high-dose HLF group；①Compared with normal control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01；③compared with model control group，P<0.05.

肝臟是體內(nèi)代謝的重要器官之一，肝組織內(nèi)含有多種代謝酶，參與機體各種代謝活動。AMPK被譽為“細胞能量感受器”[16]，是一種廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用，p-AMPK/AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，是研究高脂血癥及其他代謝相關(guān)疾病的核心。ACC可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪合成的限速酶[17]，后兩者均為前者的下游效應(yīng)因子，ACC/p-ACC在脂肪酸的合成速度調(diào)節(jié)中此起著主要作用。大量研究表明，激活AMPK，抑制ACC可以改善和治療高脂血癥[18]。

本實驗通過高脂飼料建立的高脂血癥大鼠模型來評價HLF的調(diào)節(jié)血脂作用及其機制。經(jīng)過高脂飼料誘導后，與正常對照組比較，高脂血癥大鼠血漿中TC含量大幅提高(P<0.01)，血清TG含量也大幅提高(P<0.01)，血清LDL-C含量提高(P<0.01)，肝臟指數(shù)升高，肝臟酯滴沉積明顯，提示造模成功。給予HLF小、中、大劑量后，SD大鼠血清TC、TG、LDL-C的含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，肝臟脂滴沉積明顯減少，提示HLF具有調(diào)節(jié)血脂作用。

綜上所述，HLF可調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平，減輕肝臟的脂肪浸潤，通過調(diào)節(jié)AMPK/ACC通路在大鼠肝臟中的蛋白表達水平，并具有一定的濃度依賴性，提示其調(diào)節(jié)血脂的可能機制為：通過誘導體內(nèi)p-AMPK和抑制p-ACC的表達，增加脂肪酸氧化，抑制膽固醇和減少脂肪合成來改善高脂血癥。