補(bǔ)陽還五湯減輕腦梗死小鼠神經(jīng)損傷的作用機(jī)制*

劉德浪，燕垚旬，劉衛(wèi)花，顧勇，2

(1.海南省中醫(yī)院腦病科，?？?570203；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州 510515)

腦血管病已經(jīng)成為中國第一大致死和致殘的疾病，目前臨床上治療方法有限，美國食品藥品管理局(FDA)僅將組織纖溶酶原激活物(一種用于溶栓的重組蛋白)作為唯一藥物用于治療缺血性腦卒中[1]。近兩年來，機(jī)械取栓術(shù)治療腦梗死取得巨大的成功[2]。然而，不管是溶栓藥物還是機(jī)械取栓術(shù)都有嚴(yán)格的時(shí)間窗，大多數(shù)腦梗死患者因?yàn)殄e(cuò)過短暫時(shí)間窗而未能獲得有效治療[1]。因此，研究神經(jīng)保護(hù)劑及其在腦梗死中的保護(hù)作用依然是重要的研究方向。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中風(fēng)的發(fā)病與痰、瘀、虛、風(fēng)、火等因素有關(guān)，病性多為本虛標(biāo)實(shí)，在本為元?dú)馓澨?，在?biāo)為痰火、風(fēng)瘀，氣虛血瘀是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，故在治療上以益氣補(bǔ)氣活血化瘀為治則[3]。氣虛導(dǎo)致血瘀是缺血性腦中風(fēng)的病理基礎(chǔ)，氣虛血瘀是常見腦中風(fēng)證型，臨床上經(jīng)常使用補(bǔ)陽還五湯是益氣活血祛瘀法的代表方劑[4]，該方能改善腦梗死患者的血液流變學(xué)，且療效顯著[5]。然而腦梗死病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈血管發(fā)生粥樣硬化，而這一過程與炎性反應(yīng)關(guān)系密切。因此，急性腦梗死患者臨床治療中通常采取抑制炎性因子生成的方式來逆轉(zhuǎn)斑塊形成[6-7]。

白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶M(interleukin-1 receptor associated kinase M，IRAKM)是IRAK家族成員之一，又名IRAK-3，可負(fù)調(diào)控toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)促炎信號通路，具有減輕組織炎癥損傷的作用[8]。其通過抑制IRAK-4對IRAK-1的磷酸化，進(jìn)而阻止IRAK-1與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)的解離，從而減輕下游NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[9]。本課題組近期兩項(xiàng)研究充分證實(shí)IRAKM在腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中特異表達(dá)且其誘導(dǎo)表達(dá)可介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)和梗死后的腦保護(hù)作用[10-11]。筆者本研究進(jìn)一步研究補(bǔ)陽還五湯對IRAKM表達(dá)及在基因敲除小鼠上的腦保護(hù)作用。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 基因敲除小鼠在南方醫(yī)科大學(xué)無特定病原體(SPF)動(dòng)物房飼養(yǎng)，C57BL/6野生型小鼠由Irak3雜合小鼠(Irak3-/-)交配繁殖而成。納入研究雄性Irak3基因敲除和同籠繁殖野生型小鼠，鼠齡7～10周，體質(zhì)量22～26 g。動(dòng)物予12 h的明暗循環(huán)，飼養(yǎng)平均室溫23 ℃，平均相對濕度為50%，自由進(jìn)食和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均已通過南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，并嚴(yán)格遵守中國以及美國國立研究所的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)方針，所有操作均盡最大努力減輕動(dòng)物痛苦及減少動(dòng)物使用數(shù)量。所有出生的小鼠都會(huì)取鼠尾后提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳以鑒定各基因型。

1.2材料與試劑 補(bǔ)陽還五湯所用藥材均由南方醫(yī)院購自廣州香雪制藥有限公司，由南方醫(yī)院中醫(yī)科謝煒教授鑒定均為正品。Irak3基因敲除小鼠以C57BL/6為遺傳背景并購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室(RRID：IMSR_JAX：007016)?；蚪MDNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司(CW0530S)，擴(kuò)增鑒定試劑盒購自日本Takara(R074A)。單股尼龍線栓購自美國強(qiáng)生公司；二甲亞砜(DMSO)、RIPA、2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司；TRIzol購自美國Invitrogen；白細(xì)胞介素1β(interleukin，IL-1β)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶2(COX-2)和 β-actin的引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3儀器 超聲多普勒購自美國摩爾儀器公司。小鼠腦槽購自深圳瑞沃德生物技術(shù)公司(68707)。熒光定量PCR儀LightCycler 480 II購自羅氏公司。

1.4小鼠前腦缺血-再灌注模型 小鼠在術(shù)前6 h禁食但不禁水，用異氟烷氣體麻醉，術(shù)中以加熱墊將小鼠體溫維持在(37±0.5) ℃。小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：假手術(shù)組，假手術(shù)+湯劑組，模型對照組，模型+湯劑組，每組6只。采用大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)法制備小鼠前腦缺血-再灌注模型，方法同前報(bào)道[12]。具體如下：結(jié)扎并游離頸外動(dòng)脈，切口后將7-0尼龍單股線栓通過頸內(nèi)動(dòng)脈插入大腦中動(dòng)脈，并梗阻該動(dòng)脈持續(xù)45 min。假手術(shù)組和假手術(shù)+湯劑組插入的線栓僅抵達(dá)頸內(nèi)動(dòng)脈頸段，不栓線，其他操作一樣。利用超聲多普勒檢測局部的腦血流，多普勒探頭放置在大腦中動(dòng)脈供血區(qū)(前囟后1 mm，中線側(cè)方5 mm)，分別在梗死前、梗死后、拔線栓前、拔除線栓后檢測，梗死前所測得腦血流速度為基線值，將其他狀態(tài)時(shí)腦血流表示為基數(shù)值的百分?jǐn)?shù)，局部血流降低值<70%的小鼠被排除以保證各組小鼠均一性。

1.5補(bǔ)陽還五湯的準(zhǔn)備與給藥 人用補(bǔ)陽還五湯組成：生黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍5 g，地龍、川芎、紅花、桃仁各3 g。按此配比準(zhǔn)確稱量相應(yīng)中藥，水煎濃縮成含生藥2 g·mL-1，避光，4 ℃冷藏箱中備用。依據(jù)人和小鼠體表面積折算，假手術(shù)+湯劑組，模型+湯劑組小鼠給予劑量為4 g·kg-1，每日早晚灌胃2次，在造模前灌胃給藥3 d，造模后給藥1 d，共8次，假手術(shù)組和模型對照組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。

1.6TTC染色 給藥結(jié)束后，處死小鼠后，分離小鼠腦組織，置于-20 ℃冰箱中速凍15 min，取出置于預(yù)冷小鼠腦槽。冠狀位切片，厚度1 mm，把切好的腦片浸到0.5% TTC溶液中，避光置于37 ℃放置15 min；取出腦片，用濾紙吸干液體，攝像。Image J軟件計(jì)算梗死面積并定量。

1.7熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 用TRIzol提取總RNA，定量、反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，然后再以cDNA為模板，加入TNF-α、iNOS、IL-1、β-actin的引物、熒光染料等在ABI 7500中進(jìn)行PCR反應(yīng)以對炎癥因子mRNA進(jìn)行定量。引物的序列見表1。

表1 定量PCR涉及到的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1假手術(shù)和腦梗死小鼠腦血流 腦血流檢查結(jié)果見表2。在插線栓前、插線栓后、拔線栓前、拔線栓后大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域的腦血流，可見腦血流降低約75%，局部血流降低值<70%小鼠被排除以保證各組小鼠均一性。

2.2IRAKM基因表達(dá) 熒光定量PCR法檢測IRAKM表達(dá)結(jié)果見圖1，不管是假手術(shù)或腦梗死模型，給予補(bǔ)陽還五湯能明顯提高IRAKM表達(dá)水平至少3倍以上。該結(jié)果提示IRAKM有可能參與補(bǔ)陽還五湯的神經(jīng)保護(hù)作用。

表2 兩組小鼠在血管栓塞前后、再灌注前后的局部腦血流

組別插線栓前插線栓后假手術(shù)組100±297±3模型對照組100±324±4組別拔線栓前拔線栓后假手術(shù)組95±197±2模型對照組28±891±5

A.假手術(shù)組；B.假手術(shù)+湯劑組；C.模型對照組；D模型+湯劑組；①與假手術(shù)組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01。

A.Sham operation group；B.Sham operation+decoction group；C.model control group；D.model+decoction group；①Compared with sham operation group，P<0.01；②Compared with model control group，P<0.01.

2.3IRAKM基因缺失炎癥指標(biāo) 圖2結(jié)果顯示，IL-β、IL-6和TNF-α在梗死后均有不同程度上升；對比同籠繁殖的野生型(KO)小鼠，IRAKM基因敲除(WT)后在非缺血側(cè)對IL-β、IL-6和TNF-α影響不大，而在模型對照組中，基因敲除后有進(jìn)一步增加的趨勢，尤其是TNF-α (圖2A-C)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧化酶(COX)2是腦梗死稍晚期表達(dá)并引起細(xì)胞炎性損傷的因子。結(jié)果顯示，在模型對照組中，IRAKM基因敲除后，iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)明顯進(jìn)一步增加(圖2D-E)。此外，炎癥抑制分子IL-10在基因敲除后基因表達(dá)也出現(xiàn)進(jìn)一步的增加(圖2F)。

2.4IRAKM基因敲除對補(bǔ)陽還五湯腦保護(hù)的影響 為了證實(shí)IRAKM基因是否介導(dǎo)補(bǔ)陽還五湯的腦保護(hù)作用，直接在KO和同周齡同籠繁殖WT小鼠上給予補(bǔ)陽還五湯給藥和造模。圖3，4結(jié)果顯示，在WT小鼠上，補(bǔ)陽還五湯縮小腦梗死體積，具有一定的腦保護(hù)作用；IRAKM基因敲除后，梗死體積明顯擴(kuò)大，提示該基因?qū)ι窠?jīng)損傷和保護(hù)具有調(diào)控作用。而KO小鼠在補(bǔ)陽還五湯給藥后并不能很好地發(fā)揮減小梗死體積的作用。說明IRAKM敲除后明顯削弱補(bǔ)陽還五湯在腦梗死模型中的腦保護(hù)作用。

①與非缺血WT比較，P<0.05；②與同模型WT組比較，P<0.05；③與同模型WT組比較，P<0.01。

①Compared with non-ischemia of WT，P<0.05；②Compared with the same model of WT，P<0.05；③Compared with the same model of WT，P<0.01.

圖3 補(bǔ)陽還五湯對敲除IRAKM(WT)和野生型(KO)小鼠腦保護(hù)作用

①Compared with WT+Veh，P<0.05；②Compared with WT+Veh，P<0.01.

Fig.3 Cerebral protection ofBuyangHuanwudecoction in IRAKM knockout (WT) or wild-type (KO) mice

3 討論

中風(fēng)是臨床常見病，通常根據(jù)意識情況分為中經(jīng)絡(luò)和中臟腑。目前中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)大多本虛標(biāo)實(shí)，氣虛的基礎(chǔ)上夾雜血瘀，因此，益氣活血法是治療中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)的常用治法，而補(bǔ)陽還五湯是其治療的代表方劑，目前在臨床上廣泛使用，療效顯著。本研究從抗炎機(jī)制角度抓住一個(gè)抗炎的總開關(guān)分子“IRAKM”，挖掘補(bǔ)陽還五湯的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)敲除IRAKM基因后可大大削弱補(bǔ)陽還五湯的腦保護(hù)作用，為補(bǔ)陽還五湯的作用機(jī)制研究提供了重要參考。

①與WT+Veh比較，P<0.05；②與WT+Veh比較，P<0.01。

①Compared with WT+Veh，P<0.05；②Compared with WT+Veh，P<0.01.

Fig.4 Volume percentage of cerebral infarction in four groups of mice

IRAKM在較早前報(bào)導(dǎo)僅表達(dá)于單核細(xì)胞，通過強(qiáng)烈抑制NF-κB減少炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[13-15]，該基因多態(tài)性與膿毒血癥的敏感性具有相關(guān)性[16]。但其在腦內(nèi)的定位與功能未知。本課題組曾發(fā)現(xiàn)IRAKM定位于小膠質(zhì)細(xì)胞，受到高遷移率族蛋白(HMGB1)的誘導(dǎo)并介導(dǎo)細(xì)胞的缺血耐受[10]。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，IRAKM缺失能引起多種促炎因子過度表達(dá)并加劇腦梗死小鼠的神經(jīng)血管損傷[11]，這一研究提示IRAKM作為一個(gè)重要的抗炎分子在神經(jīng)保護(hù)中重要作用。以其為靶標(biāo)分子的藥物篩選策略可能會(huì)對先導(dǎo)藥物研發(fā)具有指引作用，對解析經(jīng)典藥物的作用機(jī)制也會(huì)有很大幫助。本研究中補(bǔ)陽還五湯在假手術(shù)和缺血-再灌注模型小鼠中均能顯著誘導(dǎo)IRAKM表達(dá)，且其敲除后能顯著減少補(bǔ)陽還五湯的腦保護(hù)作用，表明補(bǔ)陽還五湯通過IRAKM表達(dá)發(fā)揮腦梗死后神經(jīng)保護(hù)。

補(bǔ)陽還五湯中活性成分眾多，黃芪含有多種黃酮成分、黃芪皂苷等成分，這些都是經(jīng)典的抗炎分子，在包括腦梗死在內(nèi)的多種神經(jīng)損傷模型中具有保護(hù)作用[17-19]。黃芪中單一成分或多個(gè)成分可從多個(gè)方面抑制谷氨酸受體，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)進(jìn)而抗腦缺血損傷的作用，與補(bǔ)陽還五湯重用黃芪具有一致性[20]。具體是哪種分子激活I(lǐng)RAKM表達(dá)還不清楚，有可能是眾多分子一起發(fā)揮IRAKM誘導(dǎo)表達(dá)的功能，原因在于IRAKM表達(dá)本身受到多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括NF-κB、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、糖皮質(zhì)激素受體(GR)和AP-1[21-24]。此外，補(bǔ)陽還五湯或其中活性成分通常都能同時(shí)抑制多種促炎因子的表達(dá)[18]，具體原因不清楚。劉娟等[25]通過觀察補(bǔ)陽還五湯對局灶性腦缺血損傷及再灌注損傷模型大鼠有明顯改善作用?？梢燥@著提高腦缺血損傷后大鼠相小窩蛋白1、2(caveolin1、2)、血管內(nèi)皮生長因子及其受體陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)，并降低腦內(nèi)一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)含量。

而IRAKM是調(diào)控這些分子的“總開關(guān)”，通過誘導(dǎo)這一個(gè)分子發(fā)揮作用，為其能同時(shí)抑制多種促炎因子表達(dá)找到解釋。然而腦內(nèi)的炎癥不僅僅是小膠質(zhì)細(xì)胞釋放，內(nèi)皮細(xì)胞、外周血巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞都或多或少地參與其中[26]。而IRAKM在腦內(nèi)僅定位小膠質(zhì)細(xì)胞，在外周血中定位于巨噬細(xì)胞，是否浸潤的巨噬細(xì)胞也能被補(bǔ)陽還五湯誘導(dǎo)出IRAKM從而發(fā)揮抗炎作用，這點(diǎn)在本文中尚不明確。

腦缺血-再灌注損傷產(chǎn)生的自由基和炎癥因子在引起梗死體積擴(kuò)大的同時(shí)，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致血腦屏障破壞和腦水腫形成。本課題組發(fā)現(xiàn)，IRAKM在縮小腦梗死體積的同時(shí)，更重要的是其可以減輕血腦屏障破壞、腦水腫形成，甚至降低腦內(nèi)出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生率[11]?？紤]到IRAKM的誘導(dǎo)補(bǔ)陽還五湯抗炎的作用，很有可能其也參與補(bǔ)陽還五湯在腦梗死過程中保護(hù)血腦屏障和腦水腫的功能，當(dāng)然這些假設(shè)還需要數(shù)據(jù)的進(jìn)一步支持。

總之，該研究進(jìn)一步拓展了IRAKM在腦保護(hù)功能，為經(jīng)典方及補(bǔ)陽還五湯的藥理機(jī)制研究提供新的靶標(biāo)分子，為充分理解的作用機(jī)制提供了線索。