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    表沒食子兒茶素對TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕脂多糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響*

    2020-06-18 01:49:58張雯宋俊科朱曉瑜楊海光許啟泰杜冠華
    醫(yī)藥導(dǎo)報 2020年6期
    關(guān)鍵詞:膠質(zhì)孵育通路

    張雯,宋俊科,朱曉瑜,楊海光,許啟泰,杜冠華

    (1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室,藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室,北京 100050;2.海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司,定安 571200)

    神經(jīng)炎癥在腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的病理進(jìn)程中扮演重要的角色[1-4]。研究表明,抑制炎癥反應(yīng)可以有效減輕卒中造成的腦部組織損傷,減輕腦水腫[5-6]。抑制炎癥反應(yīng)同樣是預(yù)防和治療帕金森病及阿爾茨海默病的有效手段[7-8]。植物多酚具有抗氧化、抗炎等多種藥理學(xué)作用。多酚類化合物被認(rèn)為是潛在的神經(jīng)保護(hù)劑,能夠調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、氧化還原和細(xì)胞分化等。多酚類化合物的攝入能夠?qū)股窠?jīng)元損傷,減緩疾病的進(jìn)程。對多酚類化合物的研究,有助于揭示天然小分子化合物對機體的影響和作用,同時有助于新型化合物發(fā)現(xiàn),指導(dǎo)新藥研發(fā)。以往的研究中,對表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)的研究較多,但對表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)研究較少[9-10]。為了明確EGC是否具有神經(jīng)細(xì)胞改善作用,筆者應(yīng)用BV2小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對象,使用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng),研究EGC對LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及機制。

    1 材料與方法

    1.1試劑 EGC購自上海源葉生物科技有限公司;達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM),胎牛血清,蛋白Marker均購自Thermo Fisher Scientific;多聚賴氨酸、LPS、Hoechst 33258、MTT均購自Sigma;一氧化氮(NO)檢測試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒,均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司;Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)p65、β-actin、Lamin B1和Anti-rabbit IgG (H+L),F(xiàn)(ab')2Fragment (Alexa Fluor?488 Conjugate)抗體均購自Cell Signaling Technology;BCA蛋白定量試劑盒購自普利萊;Goat Anti-Rabbit IgG,HRP Conjugated和Goat Anti-Mouse IgG,HRP Conjugated均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

    1.2儀器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板均購自美國Costar;SpectraMax M5酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices;Thermo Scientific ArrayScan Infinity高內(nèi)涵分析儀購自Thermo Scientific;蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad;Molecular Imager ChemiDoc XRS+ System成像儀購自美國Bio-Rad公司。

    1.3細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在37 ℃,5%二氧化碳(CO2)飽和濕度條件下培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞。

    1.4細(xì)胞模型建立及分組 選取對數(shù)生長期BV2細(xì)胞,接種于多聚賴氨酸包被的96孔板。建立LPS刺激細(xì)胞模型,LPS終濃度為1 μg·mL-1。實驗分為正常對照組,模型對照組(1 μg·mL-1LPS),EGC小劑量組(1 μg·mL-1LPS + 5 μmol·L-1EGC),EGC中劑量組(1 μg·mL-1LPS + 10 μmol·L-1EGC)和EGC大劑量組(1 μg·mL-1LPS + 20 μmol·L-1EGC)。

    1.5細(xì)胞活力檢測 實驗終點,吸去培養(yǎng)液,每孔加入0.5 mg·mL-1MTT溶液100 μL,37 ℃培養(yǎng)4 h后棄上清液,每孔加入DMSO100 μL,振蕩5 min,用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測定吸光度(A值),計算細(xì)胞存活率。

    1.6NO分泌的檢測 實驗終點,每孔取上清液50 μL,再加入Griess Reagent I 50 μL,混勻,Griess Reagent II 50 μL,混勻,在波長540 nm測定A值,計算NO濃度。

    1.7炎癥因子的檢測 實驗終點,吸去培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中,用ELISA檢測試劑盒測定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,具體操作按照說明書進(jìn)行。

    1.8Western blotting法檢測EGC對炎癥相關(guān)通路的影響 實驗終點,吸去培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,加入蛋白裂解液,冰上裂解細(xì)胞,提取胞漿和胞核蛋白,之后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳。然后將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5% BSA室溫封閉2 h后加入稀釋的一抗,4 ℃共孵育過夜。TBST洗滌3次,再與二抗稀釋液室溫共孵育2 h。TBST洗滌3次后顯影。

    1.9免疫熒光法檢測EGC對NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響 實驗終點,棄去原培養(yǎng)液,PBS洗1次后用4%多聚甲醛固定15 min。之后PBS洗1次,加入0.3% Triton-100孵育10 min。再用PBS洗1次,加入5% BSA溶液封閉1 h,然后加入稀釋的一抗4 ℃共孵育過夜。PBS洗3次,每次10 min,加入熒光二抗稀釋液,室溫孵育1.5 h。PBS洗3次,每次10 min,加入Hoechst,37 ℃避光孵育30 min,PBS洗1次,置于高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

    2 結(jié)果

    2.1LPS和EGC對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力影響 結(jié)果見圖1。實驗結(jié)果表明,與正常對照組比較,LPS作用于BV2細(xì)胞24 h,細(xì)胞存活率無顯著變化,說明1 μg·mL-1LPS對BV2細(xì)胞不存在細(xì)胞毒作用。EGC單獨作用或與LPS共同孵育BV2細(xì)胞24 h后,與對照組比較,細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明,在實驗條件下,EGC(1~100 μmol·L-1)與LPS(1 μg·mL-1)對BV2細(xì)胞無明顯毒性作用。

    圖1 LPS和EGC對BV2細(xì)胞活力的影響

    Fig.1 Effects of LPS and EGC on the viability of BV2 cells

    2.2EGC對LPS刺激BV2細(xì)胞NO分泌的影響 結(jié)果見圖2。未加入刺激時BV2細(xì)胞上清液中NO含量較低,與正常對照組比較,給予LPS刺激后,NO含量顯著增加(P<0.01)。20 μmol·L-1EGC能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生(P<0.01)。

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.EGC小劑量組;D.EGC中劑量組;E.EGC大劑量組;①與正常對照組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.01。

    圖2 EGC對LPS刺激BV2細(xì)胞NO分泌的影響

    A.normal control group;B.model control group;C.low-dose EGC group;D.medium-dose EGC group;E.high-dose EGC group;①compared with normal control group,P<0.01;②compared with model control group,P<0.01.

    Fig.2 Effects of EGC on NO production in LPS-stimulated BV2 microglia cells

    2.3EGC對LPS刺激BV2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的影響 通過ELISA法檢測各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。結(jié)果見圖3。與正常對照組比較,LPS能夠刺激BV2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6,其含量顯著高于正常對照組(均P<0.01)。EGC能夠顯著抑制LPS引起的BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌,降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.EGC小劑量組;D.EGC中劑量組;E.EGC大劑量組;①與正常對照組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.05;③與模型對照組比較,P<0.01。

    圖3 EGC對LPS刺激BV2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的影響

    A.normal control group;B.model control group;C.low-dose EGC group;D.medium-dose EGC group;E.high-dose EGC group;①compared with normal control group,P<0.01;②compared with model control group,P<0.05;③compared with model control group,P<0.01.

    Fig.3 Effects of EGC on the production of TNF-α,IL-1β and IL-6 in LPS-stimulated BV2 microglia cells

    2.4EGC對LPS刺激BV2細(xì)胞中炎癥通路的影響 Western blotting和免疫熒光法對LPS刺激的BV2細(xì)胞后TLR4/MyD88信號通路的變化進(jìn)行研究。結(jié)果見圖4。與正常對照組比較,LPS刺激后,BV2細(xì)胞中TLR4和MyD88的表達(dá)水平明顯上升(均P<0.01)。與模型對照組比較,EGC能明顯降低TLR4和MyD88的蛋白水平,抑制TLR4/MyD88信號通路的激活。

    2.5EGC抑制LPS刺激BV2細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)位 進(jìn)一步采用Western blotting和免疫熒光法,對BV2細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)進(jìn)行定位。結(jié)果見圖5,LPS刺激后細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65濃度顯著升高(P<0.01),EGC可顯著抑制LPS介導(dǎo)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。同時,EGC也能顯著抑制p-IκBα的升高,抑制炎癥反應(yīng)。

    3 討論

    筆者在本文通過建立LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,考察EGC對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明,EGC能夠顯著抑制炎癥反應(yīng),并且其抗炎作用的發(fā)揮,可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活,抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

    TLRs是天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子。TLRs被激活后,可以通過MyD88依賴性信號通路傳遞炎癥反應(yīng)信息,介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)和釋放,產(chǎn)生炎性損傷[11-13]。NF-κB是重要的炎癥調(diào)節(jié)因子,作為轉(zhuǎn)錄因子家族成員,能夠介導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-6等多種炎癥介質(zhì)和生長因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[14-16]。被NF-κB誘導(dǎo)表達(dá)的炎癥因子進(jìn)一步反饋活化NF-κB,誘導(dǎo)NF-κB的持續(xù)性活化,從而加重炎癥損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),1 μg·mL-1LPS和1~100 μmol·L-1EGC對BV2細(xì)胞無明顯毒性作用。而LPS刺激后,BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放量顯著上升,20 μmol·L-1EGC能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的NO釋放。LPS刺激后TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌均顯著高于正常對照組,10和20 μmol·L-1EGC能夠不同程度抑制TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的分泌。Western blotting和免疫熒光檢測結(jié)果表明,LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后,TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被激活,TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)明顯升高,而EGC能顯著降低TLR4和MyD88的表達(dá)水平,抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的核轉(zhuǎn)位,抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活。

    綜上所述,EGC能夠通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而減少TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的分泌,降低NO釋放,從而有效抑制LPS所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷。

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.EGC小劑量組;D.EGC中劑量組;E.EGC大劑量組;①與正常對照組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.05;③與模型對照組比較,P<0.01。

    圖4 EGC對LPS刺激BV2細(xì)胞TLR4/MyD88信號通路的影響

    A.normal control group;B.model control group;C.low-dose EGC group;D.medium-dose EGC group;E.high-dose EGC group;①compared with normal control group,P<0.01;②compared with model control group,P<0.05;③compared with model control group,P<0.01.

    Fig.4 Effects of EGC on TLR4/MyD88 signaling pathway in LPS-stimulated BV2 microglia cells

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.EGC小劑量組;D.EGC中劑量組;E.EGC大劑量組;①與正常對照組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.05;③與模型對照組比較,P<0.01。

    圖5 EGC對LPS刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞p-NF-κB和p-IκBα表達(dá)的影響

    A.normal control group;B.model control group;C.low-dose EGC group;D.medium-dose EGC group;E.high-dose EGC group;①compared with normal control group,P<0.01;②compared with model control group,P<0.05;③compared with model control group,P<0.01.

    Fig.5 Effects of EGC on p-NF-κB and p-IκBα levels in LPS-stimulated BV2 microglia cells

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