CYP19 和CYP1B1 基因多態(tài)性與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥易感性的關(guān)聯(lián)分析

周俐 姚藹娉 袁琳 沈蓮娜

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥是妊娠期婦女特有的一種并發(fā)癥,常發(fā)生在妊娠的中晚期,主要臨床癥狀為皮膚瘙癢以及膽汁酸升高,對于胎兒的生命健康造成了嚴(yán)重影響［1］。妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥會引起圍生兒發(fā)生突發(fā)性死亡,這種危害主要與病情發(fā)展具有一定的關(guān)聯(lián)性。目前對于妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的病因研究尚未明確,可能與女性妊娠期激素水平變化、遺傳、環(huán)境以及藥物等因素相關(guān)［2］。而在雌激素合成過程中關(guān)鍵酶為細(xì)胞色素P450 中的CYP19,在雌激素代謝過程中關(guān)鍵酶為細(xì)胞色素P450 中的CYP1B1,機(jī)體疾病易感性的影響因素之一為機(jī)體酶活性的差異,而酶活性與基因多態(tài)性具有一定的關(guān)聯(lián)性［3］。本文將研究細(xì)胞色素P450 中CYP19 和CYP1B1 基因多態(tài)性與感染妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥之間的關(guān)系,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院于2018年5月～2019年10月收治的50例妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者作為研究組,另選同期50例正常妊娠期孕婦作為對照組。研究組患者均已經(jīng)相關(guān)檢查確診為妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥,對照組女性均不具有妊娠期并發(fā)癥。所有研究對象及其家屬均知情并且同意本次研究。

1.2 方法 使用等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)分析兩組研究對象的CYP19 基因以及CYP1B1 基因多態(tài)性。檢測CYP19 基因多態(tài)性：采取患者靜脈血并進(jìn)行DNA 提取,使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù),參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行設(shè)計：上游引物為5'-AGTAACACAGAACAGTTGCA-3',下游引物為5'-TCCAGACTCGCATGAATTCTCCGTA-3'。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)總體積為25 μl；反應(yīng)條件：預(yù)變性(95℃)時間為5 min,變性(95℃)時間為30 s,延伸(56℃)時間為30 s,退火(72℃)時間為30 s,重復(fù)35 次后孵育(72℃)7 min；鑒定過程應(yīng)用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行；在Rsal 限制性內(nèi)切酶(5U)中加入擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl,反應(yīng)體系為15 μl,孵育(37℃)5 h 后將酶切后產(chǎn)物(5 μl)取出,再進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳實驗,結(jié)合相關(guān)結(jié)果進(jìn)行基因型的判斷工作［4］。

檢測CYP1B1 基因多態(tài)性：應(yīng)用等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù),將5'-ATGCGCTTCTCCAGG TTTGT-3' 作為公用引物,5'-TCCGGGTTAGGCCACT TCAG-3'為亮氨酸引物,5'-TCCGGGTTAGGCCACTTC AC-3'為纈氨酸引物；亮氨酸引物以及纈氨酸引物分別與公用引物進(jìn)行組合,形成兩隊引物；分別在兩個反應(yīng)體系中擴(kuò)增同一模板；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)總體積為50 μl；反應(yīng)條件為：預(yù)變性(95℃)時間為5 min,變性(94 ℃)時間為1 min,延伸(60 ℃)時間為1 min,退 火(72 ℃) 時間為1 min,重復(fù)35 次后孵育(72℃)8 min；應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定工作。

1.3 觀察指標(biāo) 分析兩組研究對象CYP19 和CYP1B1基因型,并比較兩組研究對象CYP19 和CYP1B1 的基因型頻率、等位基因頻率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象CYP19 和CYP1B1 基因型分析 CYP19 基因型：經(jīng)電泳實驗結(jié)果可知,Rsal 酶切后分出AA 型、AG 型以及GG 型。CYP1B1 基因型：經(jīng)電泳實驗結(jié)果可知有CC 型與CG 型,未發(fā)現(xiàn)有GG 型。

2.2 兩組研究對象CYP19 的基因型頻率、等位基因頻率比較 研究組患者CYP19 的AA、AG 以及GG 基因型頻率與對照組孕婦比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；研究組患者CYP19 的A、G 等位基因頻率與對照組孕婦比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象CYP19 的基因型頻率、等位基因頻率比較［n(%)］

2.3 兩組研究對象CYP1B1 的基因型頻率、等位基因頻率比較 研究組患者CYP1B1 的CC、CG 基因型頻率與對照組孕婦比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；研究組患者CYP1B1 的C、G 等位基因頻率與對照組孕婦比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象CYP19 的基因型頻率、等位基因頻率比較［n(%)］

3 討論

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥會在分娩結(jié)束后快速消失,但是疾病會在服用含有雌激素類的避孕藥情況下復(fù)發(fā),再次妊娠也會引起復(fù)發(fā)情況。其主要臨床表現(xiàn)有瘙癢以及瘙癢引起的失眠、惡心、嘔吐、食欲差以及疲勞等癥狀。臨床治療主要是針對患者瘙癢癥狀來進(jìn)行,促進(jìn)患者肝功能的恢復(fù),一般囑患者取左側(cè)臥位,有助于胎盤血流量的增加,同時給予吸氧以及營養(yǎng)支持。妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥具有地域性以及種族性,同時也具有復(fù)發(fā)性以及家族聚集傾向性,這也就說明在疾病發(fā)展過程中與遺傳因素具有一定的關(guān)聯(lián)性。在雌激素代謝過程中,關(guān)鍵酶基因的遺傳多態(tài)性會對酶的含量以及活性造成影響,從而對雌激素代謝過程產(chǎn)生影響,也就是說可以將妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的致病基因看作為雌激素代謝過程中酶相關(guān)基因［5］。

CYP19 基因能夠促進(jìn)雄烯二酮與睪酮向雌酮與雌二醇轉(zhuǎn)化的過程,具有催化作用,在產(chǎn)生雌激素的過程中發(fā)揮著重要作用。CYP19 基因共有10 個外顯子,全長＞75 kb。CYP19 基因?qū)儆诖萍に厣锖铣蛇^程中的一種編碼限速酶基因,一旦CYP19 基因發(fā)生變異,會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)雌激素相關(guān)疾病,臨床研究中常誤認(rèn)為CYP19 基因是導(dǎo)致激素依賴性疾病的致病基因。有調(diào)查研究結(jié)果顯示,CYP19 基因外顯子3 的沉默多態(tài)性與絕經(jīng)后女性的骨密度以及雌二醇水平具有相關(guān)性,AA 基因型血清雌二醇水平要高于GA 以及GG 基因型,GG 以及GA 基因型的老年女性骨質(zhì)疏松以及骨折發(fā)生率更高［6］。本次研究結(jié)果顯示,CYP19 基因多態(tài)性與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者發(fā)病不具有明顯作用,基因變異也沒有增加疾病發(fā)病風(fēng)險,當(dāng)然由于本次研究數(shù)據(jù)有限,不能就此表明二者之間不具有關(guān)聯(lián)性。CYPIB1 基因中共有3 個外顯子與2 個內(nèi)含子,全長約為12 kb。目前有調(diào)查研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYPIB1 基因型中包含6 個多態(tài)位點,其中4 個多態(tài)位點會對氨基酸造成一定的影響,引起其發(fā)生變化。在細(xì)胞色素P450 中,CYPIB1 是一種重要的酶系,在雌二醇C-4 羥化過程中發(fā)揮重要作用,可能會對酶活性產(chǎn)生影響,從而影響雌激素的代謝,繼而引發(fā)相關(guān)疾病。本次研究結(jié)果顯示在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者發(fā)病過程中,CYPIB1 不具有明顯作用,同樣本文不能證明二者之間不具有關(guān)聯(lián)性。

綜上所述,妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)生與CYP19 基因第3 外顯子Rsal 酶切以及CYP1B1 基因外顯子3 密碼432 多態(tài)性不具有明顯的關(guān)聯(lián)性,妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的易感性基因還需進(jìn)一步加大樣本進(jìn)行調(diào)查研究。