振腹法治療寒凝證類原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠優(yōu)效參數(shù)組合的探討

邵帥 于天源 耿楠 魏槃 劉迪 呂桃桃

原發(fā)性痛經(jīng)是女性的高發(fā)疾病，其中寒凝證痛經(jīng)是最主要的證型[1]。寒凝型痛經(jīng)以經(jīng)行或經(jīng)前小腹冷痛，得熱痛減，經(jīng)量少為主要臨床表現(xiàn)，其病機為陰寒內(nèi)凝，血行不暢，不通則痛。振腹療法能夠溫陽散寒、緩急止痛，對治療寒凝證痛經(jīng)療效確切，但不同的振動頻率、幅度和時間都會影響振腹療法的療效。因此，參數(shù)研究是保證振腹臨床療效的關鍵課題。目前關于振法的參數(shù)研究主要著眼于振動軌跡和頻率[2-3]，針對振法幅度和時間的研究尚顯不足。因此，本實驗從振腹的頻率、幅度和時間三個參數(shù)展開研究，采用正交設計[4]，精簡實驗參數(shù)組別，最終得出振腹療效的最優(yōu)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

使用性成熟、未交配SPF級3月齡雌性SD大鼠66只，體重(220±10)g。由北京維通利華生物技術有限公司提供，合格證號：SCXK2017-10(京)。按照隨機數(shù)字法，分為鹽水組、寒凝證痛經(jīng)模型組(簡稱模型組)和9個振腹組(振腹一組～振腹九組)，每組各6只。飼養(yǎng)條件：屏障環(huán)境，室內(nèi)溫度(23±1)℃，濕度(40±5)%，日光燈光照，普通清潔級動物飼料，自由飲用自來水。所有實驗程序均符合動物福利與倫理原則，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學動物使用和管理委員會批準。

1.2 主要儀器與試劑

P640型紅外熱成像儀(美國FLIR公司)，BC/BD-379HB臥式冰柜(青島海爾集團)，TX51顯微鏡(日本OlymPus公司)，BT223S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，5810R型高速冷凍離心機(德國EPPendorf公司)，MDF-u50A型超低溫冰箱(日本三洋公司)，全自動放免計數(shù)儀(西安核儀器廠)，推拿振法模擬儀(發(fā)明專利號：ZL 2016 2 0025264.7)。

苯甲酸雌二醇注射液(寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號120207)，縮宮素注射液(上海禾豐制藥廠，批號：120302)，戊巴比妥鈉(批號：T20080530)，美藍染色溶液(自制)。

1.3 造模方法

雌性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，每日早8點用細棉簽蘸取少量生理鹽水后緩慢插進大鼠陰道約0.5 cm，并于輕揉地旋轉后取出，把粘附陰道內(nèi)含物的細棉簽在載玻片上薄而均勻旋轉涂開，自然風干，用95%酒精固定3～5分鐘，用蒸餾水沿玻片的一端沖洗2～3分鐘后自然干燥，美藍染色5分鐘，蒸餾水沖洗后烘干固定。最后在顯微鏡下觀察陰道涂片的細胞學變化，觀察10天。選擇動情間期(白細胞占極大范圍的視野，細胞形態(tài)較小，偶見極少量的有核上皮細胞和角化上皮細胞)大鼠造模。其余大鼠繼續(xù)觀察直至動情間期再進行實驗。具體見圖1。

采用全身冷凍法結合苯甲酸雌二醇、縮宮素注射法造模[4-5]。(1)冷凍：第1～5天，將模型組和9個振腹組大鼠放入-25℃冰柜，冷凍2小時后，打開冰柜換氣10秒鐘，再冷凍2小時，將大鼠取出；(2)致敏：第1～10天，每日給予大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇，以提高子宮對致痛物的敏感度。第1天及第10天注射劑量：0.5 mg/只，第2～9天注射劑量：0.2 mg/只；(3)致痛：第10天注射苯甲酸雌二醇后1小時，腹腔注射縮宮素2 U/只，致大鼠疼痛。鹽水組每日以相同方法給予與模型組注射藥物等量的生理鹽水。

圖1 大鼠造模及干預時間安排

1.4 干預方法

鹽水組、模型組常規(guī)喂養(yǎng)。振腹組(一～九組)從致敏第6天開始治療，每日早8點治療1次，連續(xù)治療5天。治療時將大鼠四肢固定于鼠板上并暴露腹部。將“推拿振法模擬儀”直徑5 mm圓形光滑按摩頭置于大鼠腹部關元穴，并進行振腹治療。振腹治療參數(shù)根據(jù)“三因素三水平”正交實驗設計如下：即A、B、C三個因素(分別代表時間、頻率、振幅)及1、2、3三個水平(分別代表低、中、高)，根據(jù)正交實驗設計分為9組，每組具體振腹參數(shù)見表1。每組根據(jù)設定參數(shù)進行定量治療。

表1 三因素三水平振腹參數(shù)設計表

1.5 行為學指標檢測

1.5.1 扭體潛伏期 大鼠腹部疼痛時，會出現(xiàn)身體側向旋轉、腹部收縮的現(xiàn)象，稱為扭體反應。通過觀察大鼠是否出現(xiàn)扭體反應，可判斷大鼠是否出現(xiàn)痛經(jīng)。大鼠致痛后至第1次發(fā)生扭體反應的時間為大鼠的扭體潛伏期。大鼠注射縮宮素(致痛)后，立刻將大鼠放回鼠籠，同時用秒表開始計時，直至大鼠發(fā)生第1次扭體反應，記錄時間。

1.5.2 扭體評分 大鼠致痛1小時后，同時記錄各組大鼠20分鐘內(nèi)發(fā)生扭體反應的次數(shù)和等級。本實驗采用Schmauss等[6]提出的行為學評分標準，將各組大鼠扭體行為分為0～3級四個等級，分別記0～3分。0級：正常姿勢(手爪平放盒底或正常探查行為)；1級：身體斜向一邊；2級：后肢伸展，后爪背屈，軀體伸展伴盆骨頻繁側向旋轉；3級：腹部肌肉收縮，后肢后伸。觀察時間內(nèi)的總分計為扭體評分。

1.5.3 子宮體表投影溫度 寒凝證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠會出現(xiàn)子宮體表投影溫度降低[7]。通過觀察大鼠子宮體表投影溫度，能夠判斷大鼠寒凝證的輕重程度，溫度越低，寒凝證越嚴重。扭體反應觀察結束后，將大鼠固定在與紅外熱成像儀攝像頭的距離為1 m透明鼠板上，并將大鼠子宮體表投影區(qū)剃毛。大鼠致痛1.5小時后，在室溫(23±1)℃，濕度(60±5)%的條件下，使用紅外熱成像儀檢測各組大鼠子宮體表投影區(qū)溫度并記錄3次，取平均值作為該大鼠的子宮體表投影溫度。

1.6 統(tǒng)計學方法

1.6.2 正交實驗計數(shù) 計算9個振腹組各項指標的平均值并建立正交分析表。K值為所在因素三水平所對應的實驗指標和的平均值，R值為所在因素K值的極差。K值越大，該參數(shù)對該指標的療效越好。R值越大，則該因素對該指標的影響越大。通過計算K值和R值可直接判斷三因素的主次關系。以及該指標下的最優(yōu)參數(shù)。將9個振腹組各項指標，根據(jù)無空白列有重復正交實驗進行方差分析。P<0.05 為存在統(tǒng)計學意義。F值越大，則該因素對實驗結果的影響越大。綜合正交分析表和方差分析表，確定三因素的主次關系，并確定最優(yōu)參數(shù)。

表2 各組寒凝證類原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠行為學指標結果比較

注： 與鹽水組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學比較

除鹽水組的扭體潛伏期和扭體評分外，各組各項數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且方差齊。鹽水組大鼠均未出現(xiàn)扭體反應，模型組和9個振腹組大鼠均出現(xiàn)扭體反應。與鹽水組比較，模型組大鼠子宮體表投影溫度顯著下降(P<0.01)，表明模型制備成功。與模型組比較，振腹二、三、八、九組大鼠扭體潛伏期明顯延長(P<0.05)，除振腹五組外，其余振腹組大鼠扭體評分均顯著降低(P<0.05)，所有振腹組大鼠子宮體表投影溫度均增高(P<0.05)。各組大鼠各項行為學指標結果見表2。

2.2 不同參數(shù)對大鼠潛伏期的影響

A、B、C三因素對痛經(jīng)大鼠潛伏期均存在較大影響 (P<0.05)。其中A和B的影響更大(P<0.01)。根據(jù)痛經(jīng)潛伏期R值和F值大小可知，三因素的主次關系為A>B>C。且由K值可知，痛經(jīng)發(fā)作潛伏期的最優(yōu)參數(shù)組合為A3B3C2。振腹組大鼠行為學的正交分析結果見表3。

根據(jù)扭體反應R值和F值大小可知，對大鼠扭體影響最大的參數(shù)是A(P<0.01)，其次是B(P<0.01)，而大鼠扭體反應與C之間并無明顯關系(P>0.05)。說明三因素的主次關系為A>B>C。且由K值可知，扭體評分的最優(yōu)參數(shù)組合為A3B3C1。

表3 不同參數(shù)對痛經(jīng)大鼠行為學正交分析表

對痛經(jīng)大鼠子宮體表投影溫度影響最大的參數(shù)是A(P<0.01)，其次是C(P<0.05)，而子宮溫度與B之間并無明顯關系(P>0.05)，說明三因素的主次關系為A>C>B。且由K值可知，子宮體表投影溫度的最優(yōu)參數(shù)組合為A3C1B1。振腹組大鼠行為學的多因素方差分析結果見表4。

2.3 綜合三種標準下的主因素及優(yōu)效參數(shù)組合

由表3～4結果表明，振腹治療寒凝痛經(jīng)大鼠最重要的參數(shù)為治療時間。振動時間、頻率、幅度三種因素的重要程度及其最優(yōu)參數(shù)排序如下：痛經(jīng)發(fā)作潛伏期為A3B3C2，扭體評分為A3B3C1，子宮體表投影溫度為A3C1B1。綜合考慮，振腹治療寒凝痛經(jīng)大鼠的優(yōu)效參數(shù)組合為A3B3C1，即長時間、高頻率、低幅度。

表4 不同參數(shù)對痛經(jīng)大鼠行為學影響的多因素方差分析表

3 討論

振腹療法是中醫(yī)推拿的重要組成部分，能夠治療臟腑疾病，具有溫陽散寒、緩急止痛的作用[8]。行經(jīng)前在關元穴處施用振腹療法[9-10]，能夠治療寒凝血瘀證痛經(jīng)。近年來，科研人員開始運用新型測試手段對振法的相關參數(shù)進行研究，并且有了初步的認識和探討[11-12]。本實驗前期對振腹的手法參數(shù)進行了初步生物力學研究[2]，然而振腹參數(shù)與療效關系的研究仍未形成明確結論。本研究以寒凝痛經(jīng)模型大鼠為研究對象，設定振動時間、頻率、幅度三個因素及高、中、低三個水平，應用“推拿振法模擬儀”確保干預參數(shù)穩(wěn)定可控，采用正交設計精簡實驗組別，以探究振腹治療寒凝痛經(jīng)的最優(yōu)參數(shù)組合。

振腹療法能夠通過調節(jié)痛經(jīng)相關蛋白的表達以治療原發(fā)性痛經(jīng)。張巧娜[13]發(fā)現(xiàn)振腹療法可以提高原發(fā)性痛經(jīng)大鼠血清和子宮前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)表達，降低前列腺素F2(prostaglandin, PGF2)表達，抑制PGF受體在子宮內(nèi)膜上的表達，以緩解子宮平滑肌收縮，改善痛經(jīng)癥狀。周金山等[14]將辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)注入大鼠關元穴區(qū)，通過神經(jīng)束路追蹤技術研究一級感覺神經(jīng)元在脊神經(jīng)節(jié)的階段分布。結果顯示，關元穴和子宮組織的傳入投影在腰3至骶5之間的脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)匯聚重疊。這可能是子宮與關元穴聯(lián)系的解剖學基礎。

振腹療法可以解痙、溫經(jīng)、止痛。本實驗采用注射致痛劑后第1次出現(xiàn)扭體反應的時間評價大鼠疼痛的潛伏期，采用扭體反應評價大鼠疼痛程度，采用紅外熱像儀動態(tài)監(jiān)測各組大鼠子宮體表投影區(qū)溫度。根據(jù)本實驗結果，振腹干預可以明顯降低痛經(jīng)模型大鼠的扭體評分，延長扭體反應的潛伏期，提高子宮體表投影的溫度，說明振腹療法可以緩解縮宮素誘導的痛經(jīng)大鼠子宮肌的劇烈收縮，抑制子宮平滑肌痙攣，起到解痙止痛的作用，并且能夠促進子宮局部血液循環(huán)，達到溫經(jīng)止痛的目的。

振腹療法最主要的影響參數(shù)是治療時間，長時間、高頻、低幅的振動是振腹治療寒凝證類痛經(jīng)的綜合優(yōu)效參數(shù)組合。本實驗結果顯示，治療時間越長，振腹療法對潛伏期的延長、疼痛的緩解、子宮血液循環(huán)的改善就越好。而振腹頻率與振腹幅度相比，振腹頻率對疼痛的緩解作用更大，而振腹幅度在提高子宮溫度方面影響更大。但二者都對延長潛伏期有著重要作用?？紤]到每個影響因素在治療中發(fā)揮作用程度不同，根據(jù)影響因素的主次程度，選出振腹治療寒凝痛經(jīng)大鼠的綜合優(yōu)效參數(shù)組合，即長時間、高頻、低幅的振動。因此臨床振腹治療寒凝證原發(fā)性痛經(jīng)時，可以通過延長治療時間，加快振動頻率，降低振動幅度以提高療效。

本實驗設計尚有不足之處。根據(jù)正交分析，選取了9個振腹參數(shù)組合，并得出了綜合優(yōu)效參數(shù)，但該最優(yōu)參數(shù)組合并未出現(xiàn)在9個振腹組中。另外，實驗僅從行為學角度選出了振腹治療的最優(yōu)參數(shù)，而關于影響痛經(jīng)發(fā)生最重要的蛋白，如前列腺素等的表達水平卻尚未涉及。因此，下一步試驗應繼續(xù)從行為學、形態(tài)學、分子生物學角度，評判最優(yōu)參數(shù)組合的療效。

綜上所述，振腹療法能夠通過延長寒凝證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠的痛經(jīng)發(fā)作潛伏期，減輕疼痛，提高子宮溫度，以改善大鼠痛經(jīng)癥狀。振動時間、頻率、幅度是影響振腹法治療寒凝證痛經(jīng)的關鍵因素，其中時間是最主要的影響因素。長時間、高頻、低幅的振動是振腹治療寒凝證類痛經(jīng)的綜合優(yōu)效參數(shù)組合。