分離缺陷蛋白6α在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對(duì)臨床病理和預(yù)后的意義

王帥，潘景臻，華實(shí)，張健，衡雪源

1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；

2.臨沂市人民醫(yī)院微創(chuàng)與功能神經(jīng)外科，山東 臨沂 276002

膠質(zhì)瘤是一種來(lái)源于神經(jīng)外胚葉組織、由大腦或脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變導(dǎo)致的原發(fā)性顱腦腫瘤，年發(fā)病率為3～8 人/10 萬(wàn)人口[1]，經(jīng)綜合治療后中位生存期仍較短，死亡率極高，盡管接受了手術(shù)切除和放化療，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的平均生存時(shí)間只有12～15個(gè)月[2]。研究表明，膠質(zhì)瘤的發(fā)生與進(jìn)展是多基因、多步驟共同作用的結(jié)果[3]，因此從病因?qū)W研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者的早期診斷和治療以及提高腦膠質(zhì)瘤患者的生命質(zhì)量具有重要的意義。分離缺陷蛋白6 α(partitioning defective protein 6 homolog alpha，PARD6A)基因是PAR 家族的成員，該家族目前共發(fā)現(xiàn)了6 種PAR基因(PAR1-6)，其中PAR6 有三個(gè)基因亞型，分別是PARD6A、PARD6B和PARD6G，均可編碼PAR6蛋白，其分子量為37 000 kD，該細(xì)胞膜蛋白作為多蛋白復(fù)合物的成員參與不對(duì)稱細(xì)胞分裂和細(xì)胞極化過(guò)程[4]。最新的研究表明，細(xì)胞的不對(duì)稱分裂和細(xì)胞極化過(guò)程的異常均與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5]。因此，對(duì)分離缺陷蛋白的研究將對(duì)腦膠質(zhì)瘤的早期診斷、臨床治療及預(yù)后具有重要意義。

本研究利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)、GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)收集GBM、低級(jí)別膠質(zhì)瘤(LGG)和正常腦組織(Normal)的mRNA 及臨床信息資料，結(jié)合免疫組化實(shí)驗(yàn)，分析膠質(zhì)瘤中PARD6A的差異性表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。下載KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)(Molecular signatures database，MsigDB)，利用基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)技術(shù)研究PARD6A 在膠質(zhì)瘤中涉及的信號(hào)通路，研究PARD6A 在膠質(zhì)瘤中可能的發(fā)病機(jī)制，探討其作為潛在靶點(diǎn)的可行性，為膠質(zhì)瘤的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 本研究中的膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的膠質(zhì)瘤GBM、LGG 數(shù)據(jù)集(leve3，mRNA-seq、Clinical)；Normal 基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)(Genotype-Tissue Expression Project(GTEx)Brain-Cortex-GTEx mRNA-seq)。

1.2 資料篩選方法 下載GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)正常腦組織中PARD6A 的mRNA-seq 表達(dá)數(shù)據(jù)114 例；下載TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中GBM 的mRNA-seq 數(shù)據(jù)167 例，LGG的mRNA-seq 數(shù)據(jù)524 例，利用Rx643.4.1 整理。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)完整；(2)患者經(jīng)手術(shù)治療且病理結(jié)果確診為GBM或LGG。將患者信息整合為包含mRNA-seq 表達(dá)量、臨床參數(shù)和生存資料的數(shù)據(jù)集，與GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)正常腦組織中PARD6A的mRNA-seq表達(dá)量進(jìn)行差異性分析。

1.3 PARD6A 表達(dá)與臨床病理學(xué)的相關(guān)性 對(duì)TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)膠質(zhì)瘤相關(guān)PARD6A 的mRNA 和臨床數(shù)據(jù)加以分析得出，GBM 和LGG 兩組數(shù)據(jù)的PARD6A-mRNA表達(dá)量總的中位值為9.78，以PARD6A-mRNA 表達(dá)量的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定≤9.78=1，＞9.78=2，將數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，研究PARD6A 表達(dá)量與年齡、性別、膠質(zhì)瘤病理級(jí)別及生存狀態(tài)的關(guān)系。

1.4 對(duì)PARD6A 進(jìn)行生存分析 表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA) (http://gepia. cancer-pku.cn/) 是 一 款TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)在線可視化網(wǎng)頁(yè)工具，可以對(duì)目的基因進(jìn)行Kaplan?Meier Plotter在線數(shù)據(jù)生存分析。本研究中，選擇GBM-Tumor 和LGG Tumor 數(shù)據(jù)集后，利用GEPIA對(duì)PARD6A進(jìn)行總生存期(overall survival，OS)和無(wú)病生存期(disease free survival，RFS)分析。

1.5 對(duì)PARD6A 進(jìn)行單基因富集分析 以TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)PARD6A-mRNA 表達(dá)量的中位值為基準(zhǔn)，將膠質(zhì)瘤內(nèi)PARD6A-mRNA 表達(dá)量的數(shù)據(jù)分為高表達(dá)(H)組和低表達(dá)(L)組，從分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)(Molecular Signatures Database，MsigDB)下載參考集2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt，根據(jù)缺省加權(quán)富集法，隨機(jī)組合的數(shù)量定為1 000 次，名義P 值(nominal P-values，NOM P)＜0.05，錯(cuò) 誤 發(fā) 現(xiàn) 率(false discovery rates，F(xiàn)DR)＜0.25，GSEA2.2.1 軟件進(jìn)行基因富集分析，分析PARD6A參與的信號(hào)通路。

1.6 PARD6A與關(guān)鍵基因的基因的相關(guān)性 根據(jù)PARD6A 富集分析得出的信號(hào)通路，尋找這些通路中已知的關(guān)鍵基因，通過(guò)GEPIA對(duì)基因PARD6A和這些關(guān)鍵基因進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.7 臨床標(biāo)本的收集和隨訪 本研究所采用臨床標(biāo)本共68例，其中膠質(zhì)瘤樣本58例，均源于在2015年1 月至2017 年10 月期間在臨沂市人民醫(yī)院微創(chuàng)與功能神經(jīng)外科接受手術(shù)治療的原發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者；對(duì)照組腦組織樣本10例，來(lái)自于同時(shí)期急性重型顱腦損傷顱內(nèi)減壓患者。所有膠質(zhì)瘤標(biāo)本均按照世界衛(wèi)生組織(WHO 2007)神經(jīng)上皮腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本進(jìn)行分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤10 例，Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤18例，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤15例，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤15例。所納入膠質(zhì)瘤標(biāo)本均經(jīng)我院病理科證實(shí)，Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后均進(jìn)行了替莫唑胺標(biāo)椎化療方案。所有腦組織的獲取均已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的通過(guò)。隨訪納入實(shí)驗(yàn)的58例膠質(zhì)瘤患者的1年和2年腫瘤復(fù)發(fā)情況。

1.8 實(shí)驗(yàn)試劑 PAR-6家族細(xì)胞極性調(diào)節(jié)因子α抗 體(Afffinity 公 司，DF7166-100)；磷 酸 鹽 緩 沖 液(PBS，pH 7.2～7.4)，0.01 mol/L 檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)，增強(qiáng)型DAB 顯色試劑盒(20X) (索萊寶)，通用二步法檢測(cè)試劑盒(中衫，F(xiàn)V-9000-6)。

1.9 免疫組織化學(xué)法 按照通用二步法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)石蠟切片依次放入二甲苯、梯度乙醇中進(jìn)行脫蠟、水化。微波爐高火加熱0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將組織切片放入進(jìn)行抗原修復(fù)，低火維持20 min，自然冷卻至室溫后，置入蒸餾水中浸泡10 min；加入適量的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；滴加50 μL一抗(1∶50 稀釋)，4℃冰箱過(guò)夜孵育；滴加100 μL反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，滴加100 μL 增強(qiáng)酶標(biāo)兔抗山羊IgG 聚合物，室溫孵育20 min。每次操作前后均用PBS 沖洗3 min×3次，加入適量新鮮配制的DAB顯色液，室溫孵育5～8 min。自來(lái)水沖洗，蘇木素染色液孵育20 s；分化、沖洗返藍(lán)，然后脫水、封片，對(duì)照組不加入一抗，以等量PBS代替，閱片由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師依據(jù)雙盲法獨(dú)立進(jìn)行。

1.10 免疫組化染色結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 高倍鏡視野下，每個(gè)組織樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野，依據(jù)高倍鏡視野下染色呈陽(yáng)性結(jié)果的細(xì)胞在整個(gè)視野中所占比例以及陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度判定。染色結(jié)果按顯色細(xì)胞數(shù)記分：無(wú)陽(yáng)性染色細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%為1 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%為2 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%為3 分；按細(xì)胞顯色深淺記分，無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)積分相乘，0～2為陰性表達(dá)，3～9為陽(yáng)性表達(dá)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三樣本的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用以百分率(%)來(lái)表示，PARD6A 免疫組化結(jié)果與腫瘤級(jí)別的關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)，目的基因與關(guān)鍵基因的相關(guān)性分析采用皮爾遜(Pearson)法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存分析采用Kaplan?Meier在線分析。采用GSEA2.2.1版軟件從分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)(Molecular Signatures Database，Msig-DB)中獲得參照基因集2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt，然后按缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法對(duì)PARD6A 進(jìn)行單基因富集分析，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000 次，GSEA 中選取NOM P＜0.05、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates，F(xiàn)DR)＜0.25的基因集作為顯著富集基因集。

2 結(jié)果

2.1 PARD6A RNA-seq 表達(dá)水平比較 對(duì)TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中PARD6A mRNA-seq 的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GBM組PARD6A mRNA-seq表達(dá)量最低，其次為L(zhǎng)GG 組，Normal 組PARD6A mRNA-seq表達(dá)量最高，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=195.548，P＜0.05)。三組經(jīng)LSD 法兩兩比較顯示，Normal 與GBM、Normal 與LGG 以及LGG 與GBM 任意兩組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中PARD6A mRNA-seq 表達(dá)水平比較

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中PARD6A mRNA-seq 表達(dá)水平比較

注：與Normal組比較，aP＜0.05；與LGG組比較，bP＜0.05。

組別GBM組LGG組Normal組數(shù)量167 524 114 PARD6A mRNA-seq 9.31±4.98ab 10.78±4.30a 19.58±5.63b F值195.548 P值＜0.05

圖1 PARD6A mRNA-seq在TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因差異性表達(dá)

2.2 PARD6A mRNA-seq 的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 采用χ2檢驗(yàn)對(duì)PARD6A 低表達(dá)量組和PARD6A 高表達(dá)量組的年齡、性別、腫瘤級(jí)別及術(shù)后2 年的生存狀態(tài)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，PARD6A RNA-seq 表達(dá)量與患者的年齡和性別無(wú)關(guān)(P＞0.05)，但是PARD6A RNA-seq 表達(dá)量與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別以及術(shù)后2 年的生存狀態(tài)有關(guān)(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 PARD6A mRNA-seq的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)比較[例(%)]

2.3 生存分析 PARD6A Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)生存分析顯示：無(wú)論是OS 還是DFS，PARD6A高表達(dá)組(紅線)生存曲線均在低表達(dá)組(藍(lán)線)之上，且在50 個(gè)月左右時(shí)差別明顯(圖2)，即PARD6A 低表達(dá)組OS 及RFS 較PARD6A 高表達(dá)組均明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 PARD6A在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的生存分析

2.4 基因富集分析 使用GSEA 分析PARD6A對(duì)其他生物功能基因集的影響，結(jié)果顯示高表達(dá)PARD6A的腫瘤樣本富集了35條有意義的信號(hào)通路，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中包括Wnt 信號(hào)通路(圖3A)、GnRH 信號(hào)通路(圖3B)、ErbB 信號(hào)通路(圖3C)和CALCIUM信號(hào)通路(圖3D)。

2.5 PAR6蛋白在外傷腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平比較 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Par6蛋白主要位于細(xì)胞核中，陽(yáng)性染色為棕色。外傷腦組織中Par6蛋白陽(yáng)性占90.0% (9/10)；Ⅰ～Ⅱ級(jí)中陽(yáng)性占53.6% (15/28)；Ⅲ～Ⅳ級(jí)中陽(yáng)性占20.0% (6/30)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析表明，Par6蛋白在GBM組織中含量最低，其次為L(zhǎng)GG組織，腦外傷組織樣本中最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.632，P＜0.001)(表3、圖4)。以PAR6 蛋白表達(dá)情況分組，統(tǒng)計(jì)其術(shù)后1 年和2 年的腫瘤復(fù)發(fā)率，結(jié)果顯示，PAR6低表達(dá)組術(shù)后1年和2年腫瘤復(fù)發(fā)率分別為45.9%和71.8%，PARD6A 高表達(dá)組術(shù)后1 年和2 年腫瘤復(fù)發(fā)率分別為14.3%和23.8%，無(wú)論術(shù)后1 年還是2年的腫瘤復(fù)發(fā)率，低表達(dá)組相比高表達(dá)組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表4。

表3 正常腦組織及不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中PARD6A 表達(dá)水平比較[例（%）]

2.6 基因相關(guān)性表達(dá) TGFB1、Twist1、Snail 和Slug 是Wnt 信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，本研究中利用GEPIA 對(duì) 基 因PARD6A 和TGFB1、Twist1、Snail 和Slug進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PARD6A與TGFB1、Twist1、Snail 和Slug 的Pearson 相關(guān)系數(shù)R 分別為-0.44、-0.28、-0.34和-0.28，R值均為負(fù)數(shù)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示PARD6A 與TGFB1、Twist1、Snail和Slug均呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖5。

圖3 采用GSEA 2.2.1版軟件對(duì)PARD6A進(jìn)行單基因富集分析得到的部分信號(hào)通路

圖4 正常腦組織(A)，WHOI～I(xiàn)V級(jí)膠質(zhì)瘤(B～E)的免疫組化圖像(油鏡400×)

表4 不同PARD6A表達(dá)水平患者術(shù)后膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)情況比較[例（%）]

圖5 PARD6A與TGFB1、Twist1、Snail和Slug的相關(guān)性

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，起源于神經(jīng)上皮組織，這些腫瘤的特征在于無(wú)限的細(xì)胞增殖和極強(qiáng)的侵襲性[6]。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，世界多個(gè)國(guó)家相繼建立了多個(gè)大型數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)的建立為理解腫瘤發(fā)生的機(jī)制以及尋找有效的的生物標(biāo)志物提供了極其巨大的支持[7]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，利用TCGA 和GTEx 以及KEGG 等數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的數(shù)據(jù)資料，首次報(bào)道了PARD6A 在膠質(zhì)瘤中的作用。PARD6A 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所扮演的重要作用，有研究顯示PARD6A在乳腺癌[9]、肺癌[10]和前列腺癌[11]的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，然而尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于PARD6A在膠質(zhì)瘤中的研究。

在本研究中，通過(guò)分析TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤內(nèi)PARD6A-mRNA和臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)PARD6A在膠質(zhì)瘤中呈明顯低表達(dá)，并且其表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)有關(guān)，其中GBM組PARD6A表達(dá)量最低，其次為L(zhǎng)GG 組，Normal組PARD6A表達(dá)量最高，經(jīng)兩兩比較和三組數(shù)據(jù)的方差分析，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)包含的是mRNA水平的表達(dá)數(shù)據(jù)，無(wú)法反應(yīng)蛋白水平的表達(dá)情況，因此本研究通過(guò)收集臨床外傷腦組織和膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，對(duì)PARD6A進(jìn)行了蛋白水平的檢測(cè)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PAR6 蛋白主要位于細(xì)胞核中，陽(yáng)性染色為棕色。PAR6蛋白在腦外傷組織樣本中明顯高于LGG和GBM組織，且膠質(zhì)瘤病理級(jí)別越高，PAR6表達(dá)越低，染色越淺(P＜0.001)。免疫組化的結(jié)果從蛋白水平驗(yàn)證了TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤內(nèi)PARD6A-mRNA數(shù)據(jù)，因此本實(shí)驗(yàn)從mRNA水平和蛋白水平均證明基因PARD6A在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，且膠質(zhì)瘤病理級(jí)別越高，PARD6A 表達(dá)越低，染色越淺。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)數(shù)據(jù)分析還發(fā)現(xiàn)，PARD6A 的表達(dá)量還與患者的生存狀態(tài)有關(guān)(P＜0.001)，高表達(dá)組患者的生存率顯著高于低表達(dá)組，提示低表達(dá)的PARD6A 可能影響膠質(zhì)瘤的預(yù)后。為探究PARD6A對(duì)膠質(zhì)瘤患者生存的影響，利用GEPIA對(duì)PARD6A進(jìn)行了Kaplan?Meier Plotter在線數(shù)據(jù)生存分析，結(jié)果顯示PARD6A 低表達(dá)組患者的OS及RFS均較PARD6A高表達(dá)組低，并且在術(shù)后50個(gè)月左右時(shí)差別明顯，即PARD6A 表達(dá)越低，患者的生存率越低。為了探究PARD6A 表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系，本研究根據(jù)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中PARD6A表達(dá)情況的結(jié)果，結(jié)合對(duì)納入實(shí)驗(yàn)的58例膠質(zhì)瘤患者的隨訪數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)其術(shù)后1年和2年膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率，結(jié)果顯示無(wú)論是術(shù)后1年還是2年的腫瘤復(fù)發(fā)率低表達(dá)組相比高表達(dá)組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。綜合Kaplan?Meier Plotter在線數(shù)據(jù)生存分析的結(jié)果，以及對(duì)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后1 年和2 年的腫瘤復(fù)發(fā)率的統(tǒng)計(jì)，認(rèn)為PARD6A的表達(dá)與預(yù)后之間具有顯著的相關(guān)性，PARD6A表達(dá)下調(diào)明顯影響膠質(zhì)瘤的預(yù)后。

本研究為尋找PARD6A 在膠質(zhì)瘤中可能參與的機(jī)制，從KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)下載MsigDB 分子參考集(2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt)，利用基因富集分析技術(shù)和GSEA 4.0.0 軟件對(duì)PARD6A 在膠質(zhì)瘤中涉及的信號(hào)通路進(jìn)行基因富集分析。結(jié)果富集得到包括Wnt 信號(hào)通路和ErbB 信號(hào)通路、GnRH 信號(hào)通路和CALCIUM 信號(hào)通路，其中Wnt 信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤中的研究較為透徹，本研究將以該通路為主要研究?jī)?nèi)容。

在PAR 家族中，PAR3 與PAR6 關(guān)系最為密切。PAR3、PAR6 與非典型蛋白激酶C(aPKC)是極性復(fù)合體的重要組成部分，共同協(xié)調(diào)建立細(xì)胞極性[11]。這些極性復(fù)合物定位于上皮細(xì)胞的細(xì)胞連接(緊密連接和粘附連接)處，可為極性和上皮功能的建立提供一個(gè)中心調(diào)控通路[13]。在本研究中通過(guò)基因富集分析發(fā)現(xiàn)PARD6A 參與Wnt 信號(hào)通路。Wnt 通路的失調(diào)與乳腺[14]、結(jié)腸[15]和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16]等多種組織的癌變有關(guān)。在腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中，Wnt/β-catenin途徑常常異常激活，并且通過(guò)促使β-catenin 磷酸化和(或)核定位增加影響腫瘤的遷移和侵襲[17]。此外，Wnt/β-catenin 途徑還可以誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，因?yàn)榧せ畹腤nt/β-catenin信號(hào)觸發(fā)了一組EMT激活因子的表達(dá)，包括Twist1、Snail和Slug[18]。EMT與癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力密切相關(guān)，是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[1]。在EMT 過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去頂端-基底極性和細(xì)胞間連接，從而獲得間充質(zhì)運(yùn)動(dòng)表型[19-20]。巧合地是，EMT 的特征之一就是通過(guò)抑制相關(guān)極性基因的轉(zhuǎn)錄而致使細(xì)胞極性的喪失[21]。在EMT 過(guò)程中，由基因TGFB1 編碼的轉(zhuǎn)化因子β(TGF-β)因作為調(diào)控者而具有關(guān)鍵作用。TGF-β可誘導(dǎo)PAR6 發(fā)生磷酸化，通過(guò)TGF-β-PAR6 極性途徑抑制細(xì)胞極性形成，進(jìn)而發(fā)生EMT，最終引起腫瘤的無(wú)序增殖和轉(zhuǎn)移[22]。當(dāng)前對(duì)EMT 在上皮性腫瘤中發(fā)揮的作用已有較多研究。EMT是上皮來(lái)源的腫瘤獲得侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥表型的重要原因[23]。然而惡性膠質(zhì)瘤是否發(fā)生EMT，過(guò)去一直存在爭(zhēng)議[24]，但近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)顯示，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞也能夠發(fā)生EMT或EMT樣改變[25]。因此有理由推測(cè)在膠質(zhì)瘤中TGF-β可能通過(guò)TGF-β-PAR6極性途徑抑制PARD6A的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞極性的建立，引起Wnt 信號(hào)通路失調(diào)，Twist1、Snail 和Slug 的大量激活，進(jìn)而誘導(dǎo)發(fā)生EMT，最終引起腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)。不僅如此，本研究還利用GEPIA對(duì)基因PARD6A 和TGFB1、Twist1、Snail 和Slug 進(jìn) 行 了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PARD6A與這些基因呈負(fù)相關(guān)，這從側(cè)面也為本研究提供了支持。此外，本研究通過(guò)富集分析還富集到了ErbB信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路和CALCIUM 信號(hào)通路在內(nèi)的32 條信號(hào)通路，有研究表明這些信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演者重要角色[26-29]。

綜上所述，本文通過(guò)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的mRNA和臨床數(shù)據(jù)，同時(shí)結(jié)合免疫組化實(shí)驗(yàn)，首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了PARD6A基因在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，并且可能通過(guò)Wnt 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路和CALCIUM信號(hào)通路影響膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，進(jìn)一步研究其影響膠質(zhì)瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制可以為腦膠質(zhì)瘤的診斷及治療提供新的思路。