反相高效液相色譜法測(cè)定滋腎育胎丸中金絲桃苷、毛蕊花糖苷和二苯乙烯苷含量

楊麗娟 ，張君娜，苗曉紅，辛 娜

（1.河北省石家莊市婦幼保健院產(chǎn)科，河北 石家莊 050000； 2.河北省石家莊市第四醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050000； 3.河北省唐山市婦幼保健院產(chǎn)科，河北 唐山 063000）

滋腎育胎丸是由菟絲子、砂仁、熟地黃、杜仲、人參、桑寄生、阿膠（炒）、首烏、艾葉、巴戟天、白術(shù)、黨參、鹿角霜、枸杞子、續(xù)斷等15味藥材組方的中藥成方制劑，臨床用于治療脾腎兩虛、沖任不固所致滑胎，防治習(xí)慣性流產(chǎn)和先兆性流產(chǎn)[1-3]。方中菟絲子具有補(bǔ)益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉等功效[4-6]，熟地黃具有補(bǔ)血滋陰、益精填髓等功效[7-9]，杜仲具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等功效[10-12]。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第16冊(cè))》（WS3-B-3113-98），但僅對(duì)性狀、鑒別和檢查項(xiàng)作出規(guī)定，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，無(wú)法更全面地控制滋腎育胎丸質(zhì)量。方中菟絲子為君藥，杜仲為臣藥，熟地黃為佐藥，且3種藥材活性成分毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷均在紫外光區(qū)有較強(qiáng)吸收。本研究中采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法檢測(cè)中成藥滋腎育胎丸中金絲桃苷、毛蕊花糖苷和 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯 -2-O-β -D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）3種活性成分的含量[13-17]，旨在為藥品標(biāo)準(zhǔn)的完善提供技術(shù)參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-1260 INFINITY型高效液相色譜儀（包括在線(xiàn)脫氣機(jī)、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316C自動(dòng)柱溫箱和G1315C二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；BSA 124S-CW型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為十萬(wàn)分之一）；Multiskan Sky型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)熱電公司）；Milli-Q Advantage A10型純水儀（美國(guó)密理博公司）；KQ-300TDE型高頻超聲波清洗儀（昆山舒美儀器公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

圖1 高效液相色譜圖

1.2 試藥

金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)為111521-201809，含量以94.9%計(jì)），毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)為 111530-201713，含量以 92.5% 計(jì)），2，3，5，4′- 四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)為110844-201814，含量以91.0%計(jì)），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；滋腎育胎丸（廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，規(guī)格為每瓶 60 g，批號(hào)分別為 S00015，ER00012，W00103）；磷酸、冰醋酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Spherisorb ODS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5.0 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：346 nm；柱溫：27 ℃ ；流速：1.0 mL ／min；進(jìn)樣量：15 μL；流動(dòng)相：乙腈（A） -0.2%磷酸溶液（B，移取 2.0 mL磷酸至 1 000 mL容量瓶中，超聲5 min，放冷），梯度洗脫(0～6 min時(shí)12%A，6～22 min時(shí)12%A～48%A，22～30 min時(shí)48%A～80%A，30～31 min時(shí) 80%A～12%A，32～36 min時(shí)12%A)。

2.2 溶液制備

取金絲桃苷 26.34 mg、毛蕊花糖苷 27.03 mg、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯 -2-O-β-D-葡萄糖苷27.47 mg，精密稱(chēng)定，置 25 mL容量瓶中，加 95%甲醇20 mL，超聲溶解，取出放冷，定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備溶液。精密移取對(duì)照品貯備溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加95%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取樣品適量，研缽研成細(xì)粉，過(guò)80目篩網(wǎng)，取細(xì)粉1.0 g，精密稱(chēng)定，置20 mL容量瓶中，加 95%甲醇 15 mL，超聲處理（功率 200 W，頻率 60 kHz）20 min，取出放冷，加95%甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按處方制備方法和藥材配比比例，制備缺紫蘇子、熟地黃和杜仲藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷峰分離良好，分離度均不低于1.5，理論板數(shù)和拖尾因子等均符合《中國(guó)藥典》要求，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

線(xiàn)性關(guān)系考察：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液適量，加入 95% 甲醇，得質(zhì)量濃度分別為 0.04，0.10，4.00，8.00，16.00，32.00 μg ／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以3種活性成分的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷質(zhì)量濃度在 0.04 ～32.0 μg／mL 范圍內(nèi)與其峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 3種活性成分線(xiàn)性回歸方程、線(xiàn)性范圍及相關(guān)系數(shù)(n＝6)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為S00015），依法制備供試品溶液，于室溫下放置 0，3，6，9，12，24 h 時(shí)，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并根據(jù)色譜圖中3種活性成分峰面積計(jì)算 RSD。結(jié)果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷峰面積的 RSD分別為2.13%，1.02%，1.91%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為S00015）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并計(jì)算 RSD。結(jié)果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷含量的 RSD 分別為 3.09% ，2.31% ，3.38%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖；按3種活性成分峰面積計(jì)算 RSD。結(jié)果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷峰面積的 RSD 分別為 1.64%，0.93%，1.37% （n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為S00015），研缽研成細(xì)粉，過(guò) 80 目篩網(wǎng)；取細(xì)粉 1.0 g，精密稱(chēng)定，置20 mL容量瓶中，稱(chēng)取6份，依照供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，得6份樣品加樣溶液；按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算3種活性成分加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種活性成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣分析，采集色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各批樣品中3種活性成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)化

分別配制含毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷質(zhì)量濃度為8 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加95%甲醇溶解并定容，取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷分別在335，359，321 nm波長(zhǎng)處有最大吸收；取對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄190～400 nm全波段譜圖，結(jié)果于346 nm波長(zhǎng)處3種活性成分響應(yīng)最佳，故選擇346 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相優(yōu)化

曾選擇乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液和乙腈-0.4%磷酸溶液作為流動(dòng)相體系，考察不同體系對(duì)3種活性成分分離和峰形的影響。按擬訂色譜條件分別選擇上述4種流動(dòng)相體系，分別進(jìn)樣對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液和供試品溶液，采集色譜圖。結(jié)果選擇乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)，3種活性成分完全分離，且各色譜峰峰形較好。故選擇其作為流動(dòng)相體系。

3.3 色譜柱優(yōu)化

曾選擇色譜柱 Waters sunfire C18，Agilent Zorbax XDB C18，Waters Spherisorb ODS C18和 Kromasil C18作為分離柱，考察不同色譜柱對(duì)3種活性成分分離情況的影響。結(jié)果以色譜柱Waters Spherisorb ODS C18作為分離柱時(shí)，3種活性成分完全分離，故選擇其作為分析柱。

3.4 提取條件優(yōu)化

滋腎育胎丸由15味藥材加工而成，基質(zhì)較復(fù)雜，選擇最佳的提取條件對(duì)消除基質(zhì)干擾有重要作用。分別選擇甲醇和95%，90%，85%甲醇溶液時(shí)，考察對(duì)滋腎育胎丸中3種活性成分的提取效果，結(jié)果選擇95%甲醇溶液時(shí)提取效果最佳。確定提取溶劑后，分別考察超聲時(shí)間（10，15，20，25，30 min）和超聲功率（150，180，200，220，250 W）的影響，最終確定95%甲醇溶液作為提取溶劑，功率為200 W、時(shí)間為20 min為最佳提取條件。

3.5 方法評(píng)價(jià)

該方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適用于滋腎育胎丸中成藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制，可為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的完善提供技術(shù)參考。