乳核散結(jié)膠囊中相關(guān)藥材薄層色譜鑒別

張雪梅 ，張劉偉 ，梁宗鎖 ，彭玉婷 ，劉景玲

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，陜西 咸陽 712100； 2.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310038； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 咸陽 712100）

乳核散結(jié)膠囊由當(dāng)歸、黃芪、柴胡、淫羊藿等10味中藥材組方，與2015年版《中國藥典(一部)》中的乳核散結(jié)片的配方一致，具有舒肝活血、祛痰軟堅功效，可用于治療乳房腫塊結(jié)節(jié)、質(zhì)軟或中等硬、經(jīng)前疼痛加劇、乳房脹痛等癥狀[1-2]。目前，僅有少數(shù)關(guān)于其功效類似中成藥的鑒別方法[3-4]。2015年版《中國藥典(四部)》中，僅有乳核散結(jié)片中當(dāng)歸和淫羊藿的定性鑒別，未曾提到其他藥材。為有效控制此制劑的有效性和內(nèi)在質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法分別對其中柴胡、鹿銜草、當(dāng)歸、黃芪進行定性鑒別，為《中國藥典》中乳核散結(jié)片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修正和完善提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUW120型分析天平（日本島津公司，精度為0.1mg）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為 250 W，頻率為 40 kHz）；MH-2000型調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；SHB-ⅢS型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；XMTD-8222型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；KDC-140HR型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；DK-8D型三孔電熱恒溫水槽（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；薄層層析硅膠G板（青島海洋化工廠，規(guī)格為10 cm×10 cm）；薄層層析硅膠H板（青島海洋化工廠，規(guī)格為10 cm×20 cm）。

1.2 試藥

當(dāng)歸對照藥材（批號為 120927-201516），黃芪甲苷對照品（批號為 110781-200613），柴胡皂苷 a對照品（批號為110777-201510），鹿銜草對照藥材（批號為121211-201202），均購自中國食品藥品檢定研究院；乳核散結(jié)膠囊（楊凌華盛生物制藥有限公司，批號分別為170201，170301，170302，20180303，150808，20171101，170806，規(guī)格為每粒 0.43 g）；水為蒸餾水；對二甲氨基苯甲醛粉末；石油醚、甲醇、三氯甲烷、正丁醇、濃氨水、乙酸乙酯、乙醇、硫酸、甲苯、甲酸乙酯、甲酸、正己烷等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 柴胡

溶液制備：取5批樣品各10 g，研細(xì)，置錐形瓶中，加60～90℃石油醚 50 mL，超聲處理 20 min[5-7]，濾過。取濾渣，置水浴上揮盡殘留的石油醚，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾渣用少量甲醇洗滌，將洗液與濾液合并，并濃縮至干，殘渣加水10 mL，加熱使其溶解[8-9]，放冷，溶液置離心管中離心 10 min（10 000 r／min），取離心后的上清液，于分液漏斗中，加三氯甲烷，振搖提取2次，每次15 mL，棄去三氯甲烷液，水液再用水飽和的正丁醇振搖提取 3次（10，10，5 mL），合并正丁醇提取液，最后用氨試液提取 3 次（15，15，5 mL），棄去氨液，將正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[10-11]。另取柴胡皂苷a對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為 1 mg ／mL 的溶液，作為柴胡對照品溶液[7，12-13]。另取不含柴胡的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法配制陰性對照品溶液。

薄層色譜鑒別：參考2015年版《中國藥典（四部）》0502 通則中 TLC 法[14]，吸取上述溶液各 10 μL[15]，分別點于已飽和30 min的同一硅膠G薄層板上[12]。以乙酸乙酯 -乙醇 -濃氨試液 -水（8∶2∶0.5∶1，V／V／V／V）為展開劑[16]，展開，取出，晾干，再次進行二次展開，取出，晾干；噴以2%對二甲氨基苯甲醛40%硫酸溶液，用熱風(fēng)吹至斑點顯色為止[17]。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，而陰性對照品溶液在相應(yīng)位置上并未檢出斑點[18]。詳見圖1。

圖1 柴胡薄層色譜圖

2.2 鹿銜草

溶液制備：取3批樣品各5 g，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，將濾液蒸干，殘渣加水10 mL，加熱使其溶解[19]，用水飽和正丁醇進行振搖提取3次（10，10，5 mL），合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[10，20]。另取鹿銜草對照藥材 0.5 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使其溶解，作為對照藥材溶液[21]。另取不含鹿銜草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法配制陰性對照品溶液。

薄層色譜鑒別：參考2015年版《中國藥典（四部）》0502 通則中 TLC 法[14]，吸取上述溶液各 10 μL[15]，分別點于已飽和30 min的同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯 -甲酸（5∶4∶0.5，V／V／V）上層溶液為展開劑[21]，展開，取出，晾干，再次展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇液[1]，在60℃烘至斑點顯色清晰。日光下觀察，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，而陰性對照品溶液在相應(yīng)位置上未檢出斑點[18]。置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，而陰性對照品溶液在相應(yīng)位置上未檢出斑點[18]。詳見圖2。

圖2 鹿銜草薄層色譜圖

2.3 當(dāng)歸

溶液制備：取3批樣品各10 g，研細(xì)，置錐形瓶中，加石油醚（60 ～90 ℃ ）50 mL，超聲 20 min[5-7]，濾過，濾液揮至約0.5 mL，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材1 g，加石油醚（60～90 ℃ ）15 mL，超聲處理 20 min，濾過，濾液揮至約1 mL，將其作為對照藥材溶液[8]。另取不含當(dāng)歸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法配制陰性對照品溶液[22]。

薄層色譜鑒別：參考2015年版《中國藥典（四部）》0502 通則中 TLC 法[14]，吸取上述溶液各 2 μL[15]，分別點于已飽和30 min的同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9 ∶1，V／V）為展開劑，展開，取出，晾干[23]，置紫外光燈（365 nm）下檢視[24]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，而陰性對照品溶液在相應(yīng)位置上未檢出斑點[18]。詳見圖3。

圖3 當(dāng)歸薄層色譜圖（紫外光燈365 nm）

2.4 黃芪

溶液制備：取3批樣品各10 g，研細(xì)，置錐形瓶中，加石油醚（60～90 ℃ ）50 mL，超聲處理 20 min[5-7]，濾過；取濾渣，置水浴上揮盡殘留的石油醚，加甲醇50 mL，加熱回流 30 min，濾過，濾渣用少量甲醇洗滌，與濾液合并，濃縮至干，剩余殘渣加水10 mL，加熱使溶解[8]，放冷，溶液置離心管中離心10 min（轉(zhuǎn)速為3 500 r／min），取上清液置分液漏斗中，加三氯甲烷，振搖提取2次，每次15 mL，棄去三氯甲烷液[25]后的水液再用水飽和的正丁醇振搖提取 3次（10，10，5 mL），合并正丁醇提取液，最后用氨試液提取 3次（15，15，5 mL），棄去氨液[10]，將正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液[7，11-12]。另取不含黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法配制陰性對照品溶液。

薄層色譜鑒別：參考2015年版《中國藥典（四部）》0502通則中TLC法[14]，吸取空白樣品和供試品溶液各10 μL[15]，對照品溶液 5 μL，分別點于已飽和 30 min 的同一硅膠H薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V／V／V）10℃以下放置的下層溶液為展開劑[26-28]，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液[29]，在105℃烘至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，而陰性對照品溶液在相應(yīng)位置上未檢出斑點[18]。詳見圖4。

圖4 黃芪薄層色譜圖

3 討論

在TLC鑒別中，主要是要利用吸附劑對樣品中各個組分吸附能力的不同，以及展開劑對這些樣品的解吸附能力的不同，達到使各組分分離的目的[30]。以TLC進行定性鑒別時，常會出現(xiàn)人為誤差或?qū)σ恍l件選擇的不合理，如點樣操作的熟練程度、把握點樣的濃度、溶液制備、展開劑比例等，均會導(dǎo)致試驗不成功。

主藥柴胡的TLC鑒別中，對展開劑、顯色劑和干燥方法進行了研究。最初采用乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-濃氨試液 -水（10∶5∶5∶1∶1，V／V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛40%硫酸乙醇溶液，在60℃烘至斑點顯色[3]。60℃烘出來的薄層板只有對照品溶液顯紅色，供試品溶液呈現(xiàn)黑色，后換成熱風(fēng)吹干，但供試品溶液仍未顯2015年版《中國藥典》中所描述的與供試品溶液顏色相同的斑點。故從展開劑、顯色劑方面進行改進。以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V／V／V），在 10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液[30]，并在60℃加熱，置日光下檢視[21]。供試品溶液色譜中點與點之間的分離度不夠，斑點不夠清晰，存在拖尾現(xiàn)象。故最終調(diào)整展開劑，同時選擇引入濃氨水來解決拖尾問題，且適當(dāng)控制點樣的濃度和點樣量，濃度過高易拖尾，過低斑點不明顯。將濃度進行適當(dāng)稀釋，同時點的斑點小一些，且進行二次跑板以解決分離度的問題。在此過程中，還出現(xiàn)邊緣效應(yīng)問題，曾采用2種方法解決：點板盡量不要往薄層板邊緣點；在飽和展開劑的過程中把通風(fēng)櫥關(guān)掉，盡量無風(fēng)，同時保持低溫，以減小邊緣效應(yīng)的出現(xiàn)。

鹿銜草的TLC鑒別中，最初選用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.5，V／V／V）上層溶液為展開劑，結(jié)果不理想，因此參照《中國藥典》中展開劑的比例進行調(diào)整，最后選用甲苯 -甲酸乙酯 -甲酸（5∶4∶0.5，V／V／V）上層溶液為展開劑，展開結(jié)果良好，無干擾。需注意的是，對照品溶液用的是水晶蘭苷，極易分解，不宜長時間放置，最好現(xiàn)配現(xiàn)用；點板用10 cm×10 cm的硅膠G板太小，存在邊緣效應(yīng)。故換用10 cm×20 cm的薄層板（劃成10 cm×15 cm的薄層板備用），長邊作為點板處，首尾距離邊緣處稍遠。

綜上所述，相同藥材在不同的中成藥中TLC鑒別方法不一定通用，且單一味藥和復(fù)方藥中的同一種藥材的鑒別方法也有差異，需根據(jù)具體情況分析，摸索和探究找出一種最適合的方法。