葡萄糖酸鋅口服溶液中5-羥甲基糠醛限量檢查

李 玲，王秋實(shí)

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222006）

5-羥甲基糠醛（5-HMF）是葡萄糖、果糖等單糖在高溫、酸性條件或微生物的作用下脫水生成的醛類化合物，對(duì)人體橫紋肌和內(nèi)臟有損害，具有神經(jīng)毒性，能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生蓄積中毒[1-2]，還有遺傳毒性、致癌性和致突變性[3]。葡萄糖酸鋅口服溶液適用于小兒厭食癥、皮膚痤瘡、口腔潰瘍、兒童生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等缺鋅性疾病，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國(guó)藥典（二部）》[4]1276，但并未對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行控制。葡萄糖酸鋅合成的起始原料主要為葡萄糖，且口服溶液輔料中含有較多蔗糖，特別在高溫滅菌過程中[5]，極易產(chǎn)生糖的降解產(chǎn)物5-HMF。2015年版《中國(guó)藥典(二部)》對(duì)以葡萄糖為載體的注射液均進(jìn)行 5-HMF 的控制[4]215，380，489，1290，且 2015 年版《中國(guó)藥典(一部)》對(duì)藥用蜂蜜進(jìn)行了5-HMF的控制[6]。本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)葡萄糖酸鋅口服溶液中雜質(zhì)5-HMF進(jìn)行限量檢查，為提高本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型HPLC儀，包括2998PDA檢測(cè)器，Empower色譜工作站(美國(guó)Waters有限公司）；SartoriusBP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司，精度為十萬(wàn)分之一）。

1.2 試藥

5-HMF對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111626-201610，純度為 99.2%）；葡萄糖酸鋅口服溶液（廠家和批號(hào)見表1，規(guī)格為0.35%）；乙腈和甲酸均為色譜純；水為超純水。

表1 8批葡萄糖酸鋅口服溶液的廠家及批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.1% 甲酸（8 ∶92，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取5-HMF對(duì)照品10.12 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水振搖使溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。取本品5 mL，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水振搖使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

量取上述空白溶劑、對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果溶劑不干擾測(cè)定，5-HMF與相鄰雜質(zhì)均能完全分離，專屬性良好，理論板數(shù)按5-HMF峰計(jì)不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 破壞性試驗(yàn)

量取樣品（批號(hào)為20180904）5 mL，共5份，分別進(jìn)行酸破壞（加 0.2 mol／L 鹽酸溶液 2 mL，室溫放置 4 h，加0.2 mol／L氫氧化鈉溶液2 mL中和，用水定容至10 mL），堿破壞（加 0.2 mol／L氫氧化鈉溶液 2 mL，室溫放置4 h，加 0.2 mol／L 鹽酸溶液 2 mL 中和，用水定容至10 mL），氧化破壞（加3%過氧化氫溶液5 mL，室溫放置 4 h），光照破壞（置 4 500 lx，24 h，定容至 10 mL），高溫加熱（90℃水浴4 h，放冷至室溫，定容至10 mL）。分別取上述破壞溶液20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果5-HMF色譜峰與上述破壞樣品中相鄰成分峰分離良好，破壞樣品中產(chǎn)生的雜質(zhì)對(duì)5-HMF的測(cè)定無(wú)干擾。其中，5-HMF在堿和光照破壞條件下降解嚴(yán)重，穩(wěn)定性差；在氧化條件下略有降解；在酸破壞條件下穩(wěn)定性良好，基本無(wú)降解。結(jié)果見圖2。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液各適量，用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.2，1，4，10，20，40 μg／mL的系列線性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝144 134 X-23 253，r＝0.999 8(n＝6)。結(jié)果表明，5-HMF 質(zhì)量濃度在0.202～40.480 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（批號(hào)為20180904），分別于 0，2，8，12，18，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果5-HMF峰面積的 RSD為 1.16%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定5-HMF 峰面積。結(jié)果的 RSD 為 0.69% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為20180904）6份，按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果 5-HMF 含量平均值為 30.6 μg／mL，RSD為0.86%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20180904）9份，精密量取 5 mL，分別置 20 mL容量瓶中，平均分成3組，分別精密加入對(duì)照品貯備液1，1.5，2 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 5-HMF加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

檢測(cè)限和定量限確定：精密量取5-HMF對(duì)照品溶液適量，加水逐步稀釋，進(jìn)樣，根據(jù)信噪比（S／N）為3和10分別確定檢測(cè)限和定量限，結(jié)果檢測(cè)限和定量限分別為 1.0 ng 和 4.0 ng。

2.6 樣品含量測(cè)定

取 8 批(批號(hào)分別為 20190406，20180904，181113，180950，18120833，181104，20181206，180906)樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果前7批樣 品 中 5-HMF 分 別 為 1.95，30.56，39.14，39.25，0.70，3.77，41.46 μg／mL，僅批號(hào)為 180906 的樣品中未檢出。

3 討論

3.1 提取方法選擇

5-HMF易溶于甲醇、乙醇和水，曾比較甲醇、50%甲醇和水作為提取溶劑的差異，結(jié)果3種溶劑均能達(dá)到充分提取的效果?？紤]到成本及安全問題，結(jié)果選擇水作為提取溶劑，且雜質(zhì)較少。同時(shí)，考察超聲時(shí)間（0，5，10 min）對(duì)提取效率的影響，結(jié)果制備供試品溶液不需要超聲，適當(dāng)振搖即可提取完全。

3.2 檢測(cè)結(jié)果分析

共收集銷售較好的6個(gè)廠家共8批次的樣品，試驗(yàn)結(jié)果表明，8批樣品中 5-HMF 含量在 0.70～41.46 μg／mL 范圍，其中有1批未檢出5-HMF，最高質(zhì)量濃度與最低質(zhì)量濃度相差近60倍。可見，目前市售葡萄糖酸鋅口服溶液質(zhì)量參差不齊，部分廠家在生產(chǎn)工藝、儲(chǔ)存、質(zhì)量控制等方面仍不完善。為保證成品質(zhì)量，應(yīng)重點(diǎn)考察工藝合理性，制訂規(guī)范化的生產(chǎn)過程及合理的質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.3 應(yīng)用價(jià)值

葡萄糖酸鋅口服溶液兒童及成人的口服劑量范圍為 10～40 mL／d，其中 5-HMF的質(zhì)量濃度范圍為0.70 ～ 41.46 μg／mL，日暴露量則為 7.0 μg ～1.66 mg。對(duì)比以下 3種情況：1）2015年版《中國(guó)藥典（二部）》對(duì)葡萄糖注射液、以葡萄糖為載體的注射液均規(guī)定了5-HMF的限量，經(jīng)折算，日最大暴露量分別為1.75 mg（臨床常用規(guī)格為5%）和5 mg[3]，本試驗(yàn)中樣品中5-HMF含量均在允許范圍內(nèi)；2）2015年版《中國(guó)藥典（一部）》對(duì)蜂蜜規(guī)定了5-HMF的限量，經(jīng)折算，日最大暴露量為1.2 mg[3]，本研究中有4批樣品均超過日最大暴露量限度；3)5-HMF屬2類遺傳毒性雜質(zhì)，限度的制訂需按遺傳毒性雜質(zhì)要求進(jìn)行，最理想的限度是5-HMF的日暴露量為1.5 μg[3]，本試驗(yàn)中有7批樣品中5-HMF的含量遠(yuǎn)超過毒理學(xué)閾值（TTC）限度的要求，存在安全隱患，但TTC是一個(gè)高度保守的暴露量，控制指標(biāo)過于嚴(yán)格會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加和生產(chǎn)工藝的難度。由于葡萄糖酸鋅口服溶液屬口服制劑，故參考蜂蜜的5-HMF日最大暴露量來(lái)制訂本品的質(zhì)控限度，經(jīng)折算，將毒性雜質(zhì)5-HMF限度定為應(yīng)不得過30 μg／mL。建議本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增加5-HMF檢查項(xiàng)，建議部分廠家完善生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量，以保證臨床用藥安全性。葡萄糖酸鋅口服溶液臨床廣泛應(yīng)用于兒童，故控制遺傳毒性雜質(zhì)5-HMF的限量具有重要臨床意義。