重組人干擾素 -2b相關(guān)蛋白檢測和質(zhì)量分析

張伶俐 ，劉 冰 ，楊惠潔 ，王夢瑩 ，陶 磊 ，饒春明

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401121； 2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

重組人干擾素（rhIFN）為全球第二大重組蛋白藥物[1]，我國現(xiàn)有10多個(gè)廠家生產(chǎn)。2015年版《中國藥典（三部）》[2]采用分子排阻色譜（SEC）和凝膠電泳（SDSPAGE）來控制原液中的雜質(zhì)含量，未收載相關(guān)蛋白的檢測項(xiàng)目，而《歐洲藥典》[3]及《日本藥典》[4]均收載反相高效液相色譜法（RP-HPLC）檢測相關(guān)蛋白項(xiàng)目，其中以《歐洲藥典》使用范圍最廣。為提高我國生物制品標(biāo)準(zhǔn)，并與國際標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到一致，本研究中采用9.0版《歐洲藥典》中的方法，進(jìn)行了色譜柱驗(yàn)證和方法確認(rèn)，并對相關(guān)廠家重組人干擾素α-2b原液進(jìn)行了相關(guān)蛋白檢測和質(zhì)量分析。為進(jìn)一步完善該制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，同時(shí)為今后該制品的監(jiān)督管理提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：1260型液相色譜儀（包括 DAD檢測器，Agilent公司）；Jupiter-C18柱（Phenomenex 公司），Zorbax 300SB-C18柱（Agilent公司），XBridge BEH300-C18柱（Waters公司），以上色譜柱規(guī)格均為（250 mm×4.6 mm，5μm）。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，色譜儀 WatersAcquity UPLC H-Class，色 譜柱 Waters Acquity BEH300 C4柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm），Triple TOF 5600 型質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)，數(shù)據(jù)分析軟件BioPharmaView。

試藥：重組人干擾素α-2b原液（A廠家2批，B廠家3批，C廠家3批，D廠家5批，E、F、G廠家各3批，H廠家1批）；三氟乙酸、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.2 溶液制備

供試品溶液：供試品為來自國內(nèi)8個(gè)廠家生產(chǎn)的23批重組人干擾素α-2b原液，取適量注射用水稀釋至 1 mg／mL。

參比品溶液：取供試品溶液適量，加入適量的0.25%（m／m）過氧化氫溶液，使過氧化氫終濃度為0.05% （m ／m），室溫放置 1 h，每 1 mL 溶液中加入L-甲硫氨酸 12.5 mg，室溫放置 1 h。

1.3 試驗(yàn)方法

色譜條件、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及判定標(biāo)準(zhǔn)：流動(dòng)相為0.2%三氟乙酸30% 乙腈溶液（A）-0.2%三氟乙酸80%乙腈溶液（B），線性洗脫程序(0 min時(shí) 28%B，1 min時(shí)28%B，5 min時(shí) 33%B，20 min時(shí) 37%B，30 min時(shí) 43%B，40 min時(shí) 60%B，42 min時(shí) 60%B，50 min 時(shí) 28%B)；流速為 1.0 mL／min；檢測波長為 210 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣體積為50 μL。氧化峰與主峰的分離度不小于1.0，即為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)合格。主峰保留時(shí)間約為20 min，氧化型峰的保留時(shí)間為主峰的0.9倍，在主峰保留時(shí)間的0.7～1.4間積分，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于總積分面積的3.0%，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于總面積的5.0%。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜：超高效液相色譜柱溫：室溫；質(zhì)譜離子源為ESI源；質(zhì)譜采集模式為TOF MS；掃描范圍為 700～3 000 m／z；掃描時(shí)間為 1 s；離子源溫度為350℃；噴霧電壓為5 500 V；DP電壓為200 V。

2 結(jié)果

2.1 色譜柱驗(yàn)證

采用終濃度為0.05%（m／m）的過氧化氫處理目的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)氧化，制成參比品溶液。3種不同C18柱的色譜圖顯示，氧化干擾素保留時(shí)間與主峰保留時(shí)間之比均為0.9，主峰理論板數(shù)為2 800～3 000，氧化型峰與主峰的分離度約為 1.0，除某公司的 1根色譜柱略低（0.97）外，其他均滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求（見圖 1）。

圖1 不同型號(hào)色譜柱高效液相色譜圖

2.2 供試品色譜圖及色譜峰成分

選用滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求的色譜柱進(jìn)行供試

品溶液的檢測。在主峰保留時(shí)間0.9處檢出氧化型峰（見圖2）。根據(jù)一級譜圖計(jì)算得到主峰的相對分子質(zhì)量為19 265.2，與理論分子質(zhì)量偏差在1內(nèi)。氧化型峰通過去卷積計(jì)算得到其完整相對分子量為19 281.7，比主峰分子量約大16。通過肽圖分析，檢測到第16位甲硫氨酸位點(diǎn)發(fā)生氧化。色譜圖顯示，主峰有單峰和雙峰2種形式，質(zhì)譜解析單峰為IFNα-2b，雙峰為IFNα-2b和 IFNα-2b+Met；其相應(yīng)氧化型分別為 IFNα-2b+16 Da和 IFNα -2b+16 Da，IFNα -2b+Met+16 Da。

圖2 重組人干擾素 -2b相關(guān)蛋白反相高效液相色譜圖及質(zhì)譜解析

2.3 供試品相關(guān)蛋白質(zhì)量分析

結(jié)果見表 1。按1.3項(xiàng)下判定標(biāo)準(zhǔn)，8個(gè)廠家23批供試品中，3個(gè)廠家的7批供試品不符合規(guī)定，且單個(gè)雜質(zhì)峰面積和各雜質(zhì)峰面積的和這2個(gè)限值同時(shí)超標(biāo)，未出現(xiàn)僅有1個(gè)限值不符合規(guī)定的情況。供試品不合格率為30.43%，不合格廠家數(shù)占總數(shù)的37.50%。雖然2家公司的C18柱色譜峰分離度有區(qū)別，但實(shí)際檢測結(jié)果相似（見圖3）。

表1 重組人干擾素 -2b相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

3 討論

大部分生物技術(shù)類制品是由活的生物體合成，存在固有程度的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性；另外，在生產(chǎn)、原材料和／或產(chǎn)品貯存過程中也會(huì)產(chǎn)生異質(zhì)性。生物技術(shù)類制品純度分析理念經(jīng)從主藥成分轉(zhuǎn)變到相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)分析，說明分析方法的選擇和優(yōu)化主要應(yīng)考慮因素為預(yù)期產(chǎn)品與產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)的分離。另外，生物技術(shù)產(chǎn)品和生物制品的絕對純度難以測得，對測定方法有一定的挑戰(zhàn)性，且所得結(jié)果與所用方法密切相關(guān)。因此，國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)協(xié)調(diào)三方指南Q6A和Q6B指導(dǎo)原則中指出，純度一般應(yīng)采用多種方法綜合評估。應(yīng)盡量根據(jù)蛋白質(zhì)不同的理化特性，選擇原理不同的多種檢測方法，相互補(bǔ)充進(jìn)行分析。

圖3 重組人干擾素 -2b相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

當(dāng)重組蛋白發(fā)生氧化、脫酰胺、異構(gòu)化、成鹽、末端氨基酸降解、二硫鍵錯(cuò)配等化學(xué)性改變時(shí)，分子量無或僅有很微小的變化，使用分子排阻色譜或凝膠電泳難以分離[5-7]。本研究中按 9.0版《歐洲藥典》規(guī)定，利用RP-HPLC法檢測重組人干擾素α-2b的相關(guān)蛋白，可操作性、重復(fù)性和實(shí)用性均良好，但需注意色譜柱的系統(tǒng)適用性。

研究證實(shí)，我國大部分重組人干擾素α-2b原液中含有氧化型峰。蛋白質(zhì)氧化是由活性氧誘導(dǎo)的氨基酸的化學(xué)性共價(jià)修飾，可能降低蛋白質(zhì)生物活性，促進(jìn)蛋白分子聚集，增加免疫原性，促進(jìn)蛋白水解等[8-10]。按《歐洲藥典》判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量分析，供試品不合格率為30.43%。其中，3個(gè)廠家的所有批次均不符合規(guī)定，但未出現(xiàn)某個(gè)廠家某個(gè)別批次不符合規(guī)定的情況，表明與供試品的生產(chǎn)工藝密切相關(guān)。同時(shí)，對同一批樣品不同時(shí)間的穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)，氧化型峰成分可能隨時(shí)間的延長而增加。因此，監(jiān)測蛋白質(zhì)氧化在生物制藥行業(yè)中對于制造、表征和質(zhì)量控制變得至關(guān)重要。

本研究中70%的產(chǎn)品符合規(guī)定，表明我國重組人干擾素大部分產(chǎn)品的質(zhì)量均符合國際先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)要求。建議將重組人干擾素的RP-HPLC法相關(guān)蛋白檢測納入下一版《中國藥典》。部分廠家應(yīng)改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量。既適合目前我國國情，又可使我國標(biāo)準(zhǔn)與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，以整體提高我國重組人干擾素的質(zhì)量水平，并對其他重組制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高也起到一定導(dǎo)向作用。