二黃益腎湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

田雪芬，郭文廠，李冬冬 ，黃秀貞

（山東省濟(jì)寧市中醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272100）

二黃益腎湯系山東省濟(jì)寧市中醫(yī)院腎病科的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、炒白術(shù)、大黃、炙淫羊藿等10味中藥組方，具有補(bǔ)益脾腎、降濁排毒、活血通絡(luò)之功效，用于氣虛濕瘀型慢性腎功能不全（CKD 3～4期）的治療。為確定其制備工藝的合理性，全面有效控制質(zhì)量，保障臨床用藥安全、有效，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對方中大黃和白術(shù)進(jìn)行了定性鑒別，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定丹參中丹參素和原兒茶醛及淫羊藿中淫羊藿苷的含量，為進(jìn)一步完善二黃益腎湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB-135S型電子天平（Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為 300 W，頻率為 25 kHz）；ZF-8型暗箱三用紫外分析儀（上海一科儀器有限公司）。

1.2 試藥

大黃對照藥材（批號為 120984-201202），白術(shù)對照藥材（批號為120925-201611），丹參素鈉對照品（純度≥98%，批號為110855-201614），原兒茶醛對照品（純度≥99%，批號為110810-201608），淫羊藿苷對照品（純度≥98%，批號為110766-201721），均購自中國食品藥品檢定研究院；二黃益腎湯（濟(jì)寧市中醫(yī)院制劑室自制，批號分別為 20181217，20181219，20181221，規(guī)格為每瓶 150 mL）；甲醇，乙腈（色譜純，Avantor Performance Materials，Inc.，USA；GC≥99.9% ）；娃哈哈純凈水；丹參（批號為201803201）、炒白術(shù)（批號為201804122）、大黃（批號為 201801291）、炙淫羊藿（批號為201803266）等10味藥材均由濟(jì)寧邦爾中藥飲片有限公司提供，經(jīng)濟(jì)寧市中醫(yī)院劉會(huì)芳副主任中藥師鑒定為正品，均符合《中國藥典(一部)》相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

按處方稱取丹參、炒白術(shù)、大黃、炙淫羊藿等10味藥材，其中炒白術(shù)、砂仁、莪術(shù)混合加10倍量水，浸泡0.5 h，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，冷藏備用；大黃加 12倍量水，浸泡 0.5 h，微沸 5 min，濾過，備用；其余6味藥材與提取揮發(fā)油的藥渣和蒸餾后的水溶液、大黃藥渣混合，加 14倍量水，浸泡 0.5 h，煎煮 1 h，傾出煎液；藥渣再加10倍量水，煎煮40 min，傾出煎液，合并2次煎液，濾過；將濾液濃縮至約350 mL，放冷至室溫，攪拌下加入大黃濾液，冷藏、靜置過夜，濾過，濾液加熱至沸，放冷，加入上述揮發(fā)油，加純化水至450 mL，混勻，即得樣品。

2.2 薄層色譜鑒別

大黃：取樣品（批號為 20181014）30 mL，加鹽酸 2 mL，加熱回流 30 min，立即冷卻，用乙醚提取 2次，每次40 mL，合并乙醚液，溶劑揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。取大黃對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取除大黃外的其余藥材，按處方和樣品制備工藝制備不含大黃的陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。照2015年版《中國藥典(一部)》通則0502中 TLC法，吸取供試品溶液8 μL和對照藥材溶液6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯 -甲酸（7.5∶2.5∶0.6，V／V／V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰[1-3]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，置紫外光燈（365 nm）下檢視，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 大黃薄層色譜圖

白術(shù)：取樣品（批號為 20181014）90 mL，加乙醚振搖提取2次，每次100 mL，合并乙醚液，溶劑揮干，殘?jiān)迎h(huán)己烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對照藥材 2.0 g，加水 50 mL，加熱回流 30 min，放冷，濾過，用乙醚提取2次，每次60 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)迎h(huán)己烷1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取除白術(shù)外的其余藥材，按處方和樣品制備工藝制備不含白術(shù)的陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。照 2015年版《中國藥典(一部)》通則0502中 TLC法，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（2∶1，V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視[1，4]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖2。

圖2 白術(shù)薄層色譜圖

2.3 丹參素和原兒茶醛含量測定

2.3.1 色譜條件[5-7]

色譜柱：Purospher star RP-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（流動(dòng)相 A），0.4% 冰醋酸 - 水溶液（流動(dòng)相 B），0～35 min 時(shí) 3% ～10% （A）；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL ／min；進(jìn)樣量：8 μL。

2.3.2 溶液制備

分別取丹參素鈉對照品1.07 mg和原兒茶醛對照品0.27 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.097 6 g／L的丹參素對照品貯備液（1 mg丹參素鈉相當(dāng)于0.912 mg丹參素）和0.027 0 g／L的原兒茶醛對照品貯備液。按2.1項(xiàng)下方法制備樣品，精密量取5 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，過濾，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：按處方和制備工藝制備不含丹參的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。分別精密吸取上述3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。色譜圖見圖3。

線性關(guān)系考察：精密量取上述對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋成 6.1，12.2，24.4，48.8，73.2，97.6 μg ／mL系列質(zhì)量濃度的丹參素對照品溶液和 1.688，3.375，6.750，13.500，20.250，27.000 μg ／mL 系列質(zhì)量濃度的原兒茶醛對照品溶液，精密吸取上述對照品溶液各16μL，按擬訂色譜條件依法分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得丹參素的回歸方程 Y丹＝13 035.912 X丹-4 369.223，r＝1.000 0(n＝6)；原兒茶醛的回歸方程 Y原＝71 310.237 X原-6 841.460，r＝1.000 0。結(jié)果表明，丹參素和原兒茶醛的質(zhì)量濃度分別在 6.1 ～ 97.6 μg／mL，1.688 ～27.000 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖3 丹參高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述對照品混合貯備液8 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果丹參素和原兒茶醛峰面積的 RSD分別為 0.96%和 1.40%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為20181219），精密吸取供試品溶液 10 μL，按擬訂色譜條件分別于 0，4，8，12，16，24 h時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果丹參素和原兒茶醛含量的RSD 分別為 2.67%和 2.08% （n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為20181219），依法制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，各進(jìn)樣1次。結(jié)果丹參素和原兒茶醛含量的 RSD分別為2.54%和1.21%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：平行取6份已知含量的樣品（批號為20181219）45 mL，分為平行2份3個(gè)水平，分別加入含量相當(dāng)量80%，100%，120%的丹參素和原兒茶醛混合對照品，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，測量丹參素和原兒茶醛的峰面積，代入回歸方程計(jì)算。結(jié)果丹參素的平均回收率為 99.58%，RSD為2.36% （n＝ 6）；原兒茶醛的平均回收率為 101.44% ，RSD 為 1.30%（n＝6）。

定量限、檢測限確定：取上述對照品貯備液逐級稀釋，取信噪比（S／N）為10的作為定量限，丹參素和原兒茶醛的定量限分別為 11.146，1.013 ng；取 S ／N 為 3的作為檢測限，丹參素和原兒茶醛的檢測限分別為1.793 ng 和 0.006 80 ng。

2.3.4 樣品含量測定

取3批樣品，按供試品溶液制備方法平行制備2份，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中丹參素和原兒茶醛的含量。結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果（mg／100 mL，n＝3）

2.4 淫羊藿苷含量測定

2.4.1 色譜條件[8-9]

色譜柱：Purospher Star RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈 -0.1%磷酸溶液（26 ∶74，V／V）；流速：0.8 mL ／min；檢測波長：269 nm；進(jìn)樣量：8 μL。

2.4.2 溶液制備

取淫羊藿苷對照品 1.29 mg，精密稱定，置 10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.129 g／L的淫羊藿苷對照品貯備液。精密吸取樣品（批號為20181217）5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理（功率為 300 W，頻率 25 kHz） 20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液濃縮至5 mL，即得供試品溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：按處方和制備工藝制備不含淫羊藿的陰性對照樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。分別精密吸取上述3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。色譜圖見圖4。

線性關(guān)系考察：精密量取上述對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋成 8.063，16.125，32.250，64.500，96.750，129.000 μg／mL系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，精密吸取上述對照品溶液各16 μL，按擬訂色譜條件及方法分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以對照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得淫羊藿苷的回 歸 方 程 Y＝33 267.217X+10 163.538， r＝1.000 0(n＝6)。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在 8.063～129.000 μg ／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述對照品貯備液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄淫羊藿苷的峰面積。結(jié)果的 RSD為0.48%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為20181217），依法制備供試品溶液，精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件分別于0，4，8，12，16，24 h 時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果淫羊藿苷含量的RSD為2.49%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為20181217），依法制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果淫羊藿苷含量的 RSD為 1.84%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：平行取6份已知含量的樣品各10mL，分為平行2份3個(gè)水平，分別加入含量相當(dāng)量80%，100%，120%的淫羊藿苷對照品粉末，依法制備供試品溶液，每次進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖，測量淫羊藿苷的峰面積，代入回歸方程計(jì)算。結(jié)果淫羊藿苷的平均回收率為 99.80%，RSD 為 1.08%（n＝6）。

定量限、檢測限確定：取上述對照品貯備液逐級稀釋，取信噪比（S／N）為10的作為定量限，淫羊藿苷的定量限為 1.954 ng；取 S／N為 3的作為檢測限，淫羊藿苷的檢測限為0.279 ng。

2.4.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為20181217，20181219，20181221）樣品，依法平行制備2份供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算含量。結(jié)果見表1。

圖4 淫羊藿高效液相色譜圖

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別要求

對白術(shù)進(jìn)行薄層色譜鑒別時(shí)，105℃加熱至紫外燈下檢視，主斑點(diǎn)不清晰，105℃加熱時(shí)間略長，但羧甲基纖維素未碳化變黑后，主斑點(diǎn)顯色清晰。對大黃進(jìn)行薄層鑒別時(shí)，參考2015年版《中國藥典(一部)》中八正合劑相應(yīng)藥材的鑒別方法，方法簡單、合理，斑點(diǎn)顯色清晰，分離效果好。

3.2 丹參中有效成分含量分析指標(biāo)確定

丹參中有效成分主要為脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類化合物，2015年版《中國藥典(一部)》規(guī)定了丹參的含量測定成分為丹參酮類和丹酚酸B。丹參酮類化合物具有脂溶性高、對光和溫度不穩(wěn)定、半衰期短等缺點(diǎn)。GONG等[10]報(bào)道了丹酚酸B受熱后降解為丹酚酸A、咖啡酸、丹酚酸C、丹參素、原兒茶醛等，其降解產(chǎn)物可作為以丹酚酸B為指標(biāo)進(jìn)行含量分析的物質(zhì)基礎(chǔ)。原兒茶醛具有抗氧化、抑制血小板聚集、改善腎臟血循環(huán)、減輕急性腎損傷引起的腎小管壞死的作用[11]；丹參素可降低腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞的比率，維持腎小管上皮細(xì)胞的正常形態(tài)[12]。對含有丹參的中藥復(fù)方制劑進(jìn)行含量測定時(shí)，多以丹參素和原兒茶醛作為指標(biāo)[13]。故本試驗(yàn)中選擇了丹參中的2種水溶性成分（丹參素和原兒茶醛）為指標(biāo)進(jìn)行含量分析。

3.3 流動(dòng)相選擇

流動(dòng)相采用了甲醇（B）-0.4%冰醋酸水溶液（C）等度洗脫[14]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰形拖尾較嚴(yán)重，樣品中化合物的峰高被壓得很低。選擇流動(dòng)相乙腈（B）-0.4%冰醋酸水溶液（C）梯度洗脫，0～7 min時(shí) 2% ～5%（B），7～35 min 時(shí)5% ～13%（B）[5]，但原兒茶醛與其前面一個(gè)未知峰未分開。經(jīng)多次調(diào)整梯度洗脫的流動(dòng)相比例，但峰形越來越無法分開，因此減少梯度洗脫比例變化的幅度，采用乙腈（B）-0.4% 冰醋酸水溶液（C）梯度洗脫，0～40 min時(shí) 3% ～9% （B）、0～35 min 時(shí) 3% ～11% （B），前者出峰時(shí)間較長，后者原兒茶醛與其前面一個(gè)峰相鄰太近。最后采用0～35 min時(shí)3% ～10%（B）的比例，則丹參素和原兒茶醛可完全與雜峰分離，且峰形和出峰時(shí)間較好。

3.4 淫羊藿流動(dòng)相和檢測波長選擇

淫羊藿中多以淫羊藿苷為指標(biāo)進(jìn)行含量測定[15-16]。曾考察乙腈 -水（25∶75，26∶74，28∶72，30∶70，V／V)，其中流動(dòng)相比例為25∶75時(shí)出峰時(shí)間太長，為28∶72和30∶70時(shí)基線不穩(wěn)，為26∶74時(shí)樣品分離度良好，略有拖尾。故確定用乙腈 -0.1% 磷酸水溶液（26∶74，V／V）作為淫羊藿苷的流動(dòng)相。使用二極管陣列檢測器（PDA）進(jìn)行了全波長掃描（190～800 nm），結(jié)果淫羊藿樣品在269 nm波長處淫羊藿苷有較大吸收，且雜質(zhì)成分干擾少，故選擇269 nm作為淫羊藿苷的檢測波長。