QuEChERS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測中藥飲片中黃曲霉毒素

孫夏榮，葛曉明，王建花

（江蘇省南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 211198）

黃曲霉毒素（aflatoxins）是由黃曲霉和寄生曲霉中某些產(chǎn)菌毒株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素，是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素，常見有 B1，B2，G1，G24 種，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大、致癌性最強(qiáng)，其毒性相當(dāng)于氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）劃定為Ⅰ類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)[1-4]。中藥材及其制劑在儲存過程中常會發(fā)生霉變，產(chǎn)生很多對人體有害的真菌毒素[5-6]，2015年版《中國藥典(一部)》已規(guī)定了部分中藥材品種黃曲霉毒素B1的限量不得超過5 μg／kg、黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的總量不得超過 10 μg ／kg[7]。

目前，文獻(xiàn)報道的黃曲霉毒素檢測方法主要有薄層色譜（TLC）法[8]、酶聯(lián)免疫（ELISA）法[9]、高效液相色譜（HPLC）法[10-11]、液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS ／MS）法[12-13]等。樣品的前處理方面，現(xiàn)行《中國藥典》執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)為免疫親和柱凈化法聯(lián)用色譜技術(shù)，由于免疫親和柱填料大多采用進(jìn)口填料，單根免疫親和柱售價約為100元，若長期使用則相關(guān)檢測成本較高。LC-MS／MS法專屬性好、靈敏度高、抗干擾強(qiáng)，能有效排除假陽性的干擾，適合在復(fù)雜基質(zhì)下同時篩查痕量的多種黃曲霉毒素。

QuEChERS（quick，easy， cheap，effective， rugged，safe）是由美國農(nóng)業(yè)部的化學(xué)家ANASTASSIADAS等于2003年提出的一種快速樣品前處理技術(shù)[14-15]，用于農(nóng)藥殘留的檢測。該方法具有分析快速、回收率高、精確度和準(zhǔn)確度好、使用溶劑量少、污染少、操作簡便等優(yōu)點，近年來主要用于農(nóng)產(chǎn)品和食品的各項檢測中，但在藥品的檢測中應(yīng)用較少。本研究中采用基于QuEChERS原理的樣品前處理的快速提取方法，結(jié)合超高效液相色譜(UPLC)-MS／MS法，建立中藥飲片中4種黃曲霉毒素（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2）的檢測方法，提供一種不使用免疫親和柱的黃曲霉毒素的檢測思路，為藥品的監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 6470型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括電噴霧離子化源（ESI）、MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國安捷倫公司）；CPA225D型電子天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）；渦旋混勻器（德國維根公司）；X-30R型冷凍離心機(jī)（德國 Beckman公司）；Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國默克公司）；N-EVAP 24型氮吹儀（美國 Organomation公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為 30 kHz）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈（色譜純，Honeywell公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，Aladdin公司）；無水硫酸鎂（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；水為超純水；黃曲霉毒素混合對照品 （ 批 號 為 610001-201804）， AFB1，AFB2，AFG1，AFG2含量分別為 0.93，0.30，0.93，0.35 μg ／mL，均購自中國食品藥品檢定研究院；陳皮、大棗、柏子仁均為市售樣品或抽樣樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18RRHD柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：2 mmoL ／L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸，流動相A）-乙腈（流動相B），按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.3 mL ／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源模式(ESI)：正離子模式；毛細(xì)管電壓4 000；霧化器流速：9 L／min；干燥器溫度：325℃；霧化器壓力：40 psi（1 psi＝ 6.89 kPa）；鞘氣溫度：350 ℃ ；鞘氣流量：11 L／min；掃描模式：動態(tài)多反應(yīng)離子監(jiān)測（DMRM）。相關(guān)質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

2.2 溶液制備

分別精密量取黃曲霉毒素混合對照品1 mL，置20 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液稀至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用70%甲醇溶 液 稀 釋 成 每 1 mL 含 AFB1，AFG10.093， 0.465，0.930， 1.860， 3.720， 9.300 ng， AFB20.030， 0.150，0.300， 0.600， 1.200， 3.00 ng， AFG20.035， 0.175，0.350，0.700，1.400，3.50 ng 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取供試品粉末 2 g（過3號篩），精密稱定，置50 mL離心管中，加入 80%乙腈溶液（含 0.1%甲酸）20 mL，超聲10 min，離心 5 min（離心速率 10 000 r／min），取上清液，再加入0.5 g氯化鈉和2 g無水硫酸鎂，充分渦旋振蕩2 min，離心 5 min（離心速率 6 000 r／min），取上清液1 mL用50℃氮氣吹干，快速加入2 mmoL／L乙酸銨溶液（含 0.1% 甲酸）-乙腈（65 ∶35，V／V）1 mL，過微孔濾膜（0.22 μm），取濾液，供 LC-MS ／MS 分析。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取6個不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，ng／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表3。

精密度試驗：取同一質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（AFB1， AFG10.930 ng ／mL； AFB20.300 ng ／mL； AFG20.350 ng ／mL），進(jìn)樣 6 次。測定結(jié)果見表 3，各組分峰面積的 RSD均在 1.80% ～3.52%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：精密稱取空白樣品2 g（過3號篩），共6份，加入標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.1 mL，按供試品溶液制備方法制備，按擬訂條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3，上述各組分峰面積的 RSD＜4.00%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

表2 黃曲霉毒素的質(zhì)譜離子參數(shù)

穩(wěn)定性試驗：取重復(fù)性試驗項下供試品溶液1份，置室溫，分別于 0，4，8，12，24 h 時依法進(jìn)樣測定。結(jié)果見表 3，各組分峰面積的 RSD ＜5.00%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

檢測限與定量限確定：將混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液加入空白樣品溶液中，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定。以信噪比（S／N）為 3∶1確定各組分的檢測限（LOD），當(dāng) S／N為10∶1確定各組分的定量限（LOQ）。結(jié)果見表3。

準(zhǔn)確度試驗：取空白樣品2 g，精密稱定，共18份，每6份按低、中、高3種質(zhì)量濃度水平分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)貯備液 0.05，0.10，0.50 mL，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 黃曲霉毒素方法學(xué)考察結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

對10批市售樣品進(jìn)行測定，結(jié)果在2批樣品中檢出AFB1，其余均未檢出。詳見圖1和圖2。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

曾考察不同比例的甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、乙酸銨-乙腈系統(tǒng)等多個流動相體系進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果顯示，在2 mmoL／L乙酸銨溶液的流動相體系下，各化合物的響應(yīng)值最高、峰形較好，且加入一定量的甲酸可進(jìn)一步提高各化合物的離子化效率，故選取2 mmoL／L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈系統(tǒng)為流動相。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本試驗中對影響離子化效率的干燥器溫度、鞘氣溫度、鞘氣流量、霧化器壓力、毛細(xì)管電壓、碰撞能量等條件均進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇電噴霧正離子掃描模式，得各化合物最佳的質(zhì)譜條件。

圖1 黃曲霉毒素定性和定量離子對的DMRM圖

3.3 樣品前處理優(yōu)化

提取溶劑選擇：曾考察不同提取溶劑對4種黃曲霉毒素的提取效率，比較了甲醇、乙腈、不同比例的酸化甲醇水溶液（含0.1%甲酸）、不同比例的酸化乙腈水溶液（含0.1%甲酸），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同類型的提取溶劑對黃曲霉毒素的提取效率存在差異。當(dāng)提取溶劑為80%乙腈溶液（含0.1%甲酸）時，提取效率最高，各化合物回收率均超過85%，且選擇高有機(jī)相比例的提取溶劑，可明顯縮短氮吹時間，節(jié)約試驗時間。因此，確定80%乙腈溶液（含0.1%甲酸）為提取溶劑。

提取方式選擇：曾考察超聲波提取、渦旋振蕩提取2種方式對提取效率的影響，結(jié)果無顯著性差異。從試驗操作的方便性考慮，宜采用超聲波提取。此外，進(jìn)一步比較了不同超聲時間（2，5，10，20，30 min）對提取結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，樣品超聲處理10 min和20 min與30 min相比，回收率無顯著差異，故選擇超聲處理10 min。

鹽析劑和復(fù)溶溶劑選擇：QuEChERS方法中鹽析劑對黃曲霉毒素的回收率也有一定影響。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，0.5 g氯化鈉和2 g無水硫酸鎂能促進(jìn)提取液分層，回收效率最高。曾考察樣品在氮吹蒸干后不同的復(fù)溶溶劑對試驗的影響，比較甲醇、乙腈、2 mmoL／L乙酸銨溶液（含 0.1% 甲酸）-乙腈（65 ∶35，V／V）的復(fù)溶溶液，結(jié)果直接采用甲醇或乙腈作為復(fù)溶溶液，會出現(xiàn)溶劑效應(yīng)。故最終選擇2 mmoL／L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈（65∶35，V／V）作為復(fù)溶溶液，也作為流動相的初始比例溶液。

圖2 典型陽性供試品定性和定量離子對的DMRM圖

3.4 方法評價

本研究中建立了基于QuEChERS原理的樣品前處理方法，結(jié)合UPLC-MS／MS技術(shù)，建立中藥飲片中4種黃曲霉毒素（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2）的檢測方法。該方法快速簡便、操作性強(qiáng)、靈敏度高，為中藥飲片中快速檢測4種黃曲霉毒素提供了新的研究思路和參考。