淫羊藿配方顆粒制備工藝優(yōu)化及一致性評價

郭 冬 ，薛佩蕓 ，穆慶麗 ，喬 園 ，陳 萍 ， ，曹雅靜

（1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 717300）

淫羊藿 Epimedium brevicornum Maxim.為小檗科多年生直立草本植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿或朝鮮淫羊藿的地上部分[1-3]，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，主治陽痿早泄、腰酸腿痛、四肢麻木、半身不遂、神經(jīng)衰弱、健忘、耳鳴、目眩等癥[4-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿對陽痿、遺精、骨質(zhì)疏松、手足麻木拘攣、更年期高血壓、心腦血管疾病及提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老等療效顯著。目前，已分離出多種成分，主要為異戊烯基黃酮類，一般認(rèn)為8-異戊烯基黃酮及其苷類為主要活性成分，其中淫羊藿苷為特征成分，具有促進(jìn)神經(jīng)突觸生長、抵抗神經(jīng)元損傷、改善骨代謝、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗抑郁和抗腫瘤等活性[6-8]。本研究中探討了淫羊藿配方顆粒制備工藝的優(yōu)化及一致性評價，旨在為生產(chǎn)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（包括自動進(jìn)樣器，四元泵，柱溫箱，vwd檢測器，美國Agilent公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為 1 500 W，頻率為 40 kHz）；BT25S型電子天平，BS210S型電子天平（精度為十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司)；CP2102型電子天平（精度為萬分之一，奧豪斯儀器＜常州＞有限公司）；ZLG型中藥浸膏專用離心噴霧干燥機(jī)（浙江錢江偉岸干燥設(shè)備有限公司，功率為63 kW）；GZL100-25L型干法制粒機(jī)（石家莊科源機(jī)械設(shè)備有限公司，功率為7.5 kW）；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；水為純凈水；甲醇、乙醇等試劑均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品（批號為110737-201516，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）；淫羊藿飲片(陜西興盛德中藥飲片有限公司，批號分別為20180301，20180310，20180510），經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所炮制鑒定室主任楊智峰研究員鑒定為正品；淫羊藿配方顆粒（陜西必康制藥集團(tuán)控股有限公司，批號分別為20180915，20180916，20180917）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化[9-12]

2.1.1 單因素考察

浸泡時間考察：精密稱取淫羊藿飲片（批號為20180301）50 g，共 3 份，依次加水 800 mL，攪勻，浸泡，分別于 20，40，60，80，100 min 時濾出藥液，讀取體積，直至體積不再減少則停止觀察。結(jié)果顯示，浸泡60 min后，藥液體積基本不再增加，計算吸水倍數(shù)為0.2，故加水量不得低于10倍量。詳見表1。

表1 淫羊藿浸泡時間單因素考察結(jié)果（mL）

煎煮時間：取淫羊藿飲片21份，每份50 g，依次加水 650 mL，精密稱定，依次加熱回流 15，30，45，60，75，90，120 min，每個時間點平行試驗3次，煎煮液濾過，冰箱靜置24 h后，離心，量取上清液100 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃烘至恒重，即可。結(jié)果提取90 min后，干膏基本無明顯變化。

2.1.2 正交試驗

煎煮工藝條件優(yōu)選：影響水煎煮的主要因素通常有浸泡時間、煎煮時間、加水量、煎煮次數(shù)及粒度，考慮大生產(chǎn)通常以飲片投料，因此重點考察浸泡時間（因素A）、加水量（因素 B）、煎煮時間（因素 C）、煎煮次數(shù)（因素D）4個因素，詳見表2。

表2 正交試驗因素水平

正交設(shè)計及結(jié)果：以 L9（34）表安排試驗，以淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷為考察指標(biāo)，結(jié)合干浸膏得率進(jìn)行方差分析，以 P值判斷影響因素的差異性，得煎煮最佳工藝。

2.1.3 干膏率測定

精密量取各煎煮液100 mL，分別置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣于105℃干燥3 h，取出，置干燥器中放置 30 min，稱定質(zhì)量，計算出膏率（% ）。 Y（% ）＝（m1／100×V）／m2×100%（m1為干浸膏質(zhì)量，V為樣品溶液體積，m2為飲片質(zhì)量）。

表3 正交試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析

2.1.4 方差分析

依據(jù)表3正交試驗安排和試驗數(shù)據(jù)，以干膏率（%）占 50%、淫羊藿總黃酮（UV法，%）及淫羊藿苷量（HPLC法，mg）各占25%為基數(shù)，計算綜合值，以綜合值進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4?？梢姡饕蛩刈饔弥鞔螢橐蛩?D＞因素 C＞因素 A＞因素 B；方差分析結(jié)果顯示，D因素有顯著性差異（P＜0.05），C因素次之，因素A和因素B無顯著性差異（P＞0.05）。綜合考慮，確定最佳工藝為 A2B2C2D3，即浸泡0.5 h，加12倍量水，煎煮3 次，每次煎煮 1.5 h。

表4 方差分析結(jié)果

2.1.5 驗證試驗

精密稱取淫羊藿飲片50 g，精密稱定，共3份，按最佳工藝進(jìn)行驗證試驗。結(jié)果淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷及干膏率均大于或接近于正交試驗表中的最高值，且重復(fù)性好，工藝相對穩(wěn)定、合理。詳見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果

2.2 淫羊藿苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 - 水（28 ∶72，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：270 mn；柱溫：30℃。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計應(yīng)不低于1 500。

2.2.2 溶液制備

取對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含無水淫羊藿苷270.8 μg的溶液，作為對照品溶液。精密量取表3中1～9號水煎液各5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。精密吸取5 mL蒸餾水，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，作為陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2.2項下3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件測定。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置處有吸收，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密量取淫羊藿苷對照品液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置 5 mL 容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷質(zhì)量濃度為5.416，27.08，54.16，81.24，108.32，135.40，162.48 μg ／mL 的溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)2次。以淫羊藿苷峰面積平均值（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得淫羊藿苷線性回歸方程 Y＝21.602 75 X-1.193 23， R2＝ 0.999 95(n ＝ 7)。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在 2.708 ～162.48 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2.2項下對照品溶液與供試品溶液各 10 μL，分別重復(fù)進(jìn)樣 6次。結(jié)果的 RSD分別為0.55% 和 0.60%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取飲片（批號為20180301）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于0，1，2，4，8，12，20 h 時測定峰面積。結(jié)果的 RSD 為3.24%（n＝7），表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取飲片（批號為20180301）6份，每份50g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果的 RSD為5.01%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：分別精密量取重復(fù)性試驗項下6份樣品溶液各1 mL，置5 mL容量瓶中，加入適量淫羊藿苷對照品溶液，以甲醇定容至刻度，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表6。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 淫羊藿總黃酮含量測定

溶液制備：取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10.832 μg的溶液，即得對照品溶液。精密量取表3中1～9號水煎液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

測定法：分別取供試品溶液和對照品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，按2015年版《中國藥典》通則0401紫外-可見分光光度法，于270 nm波長處測定吸光度，并計算。結(jié)果見表3。

表6 淫羊藿苷加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.3 配方顆粒制備及中試數(shù)據(jù)[13]

取 3批飲片（批號分別為 20180301，20180310，20180510）各 80.0 kg，以上述最佳工藝進(jìn)行提取（浸泡0.5 h，加 12 倍量水，煎煮 3 次，每次 1.5 h，）濾過，合并3次濾液，于60℃減壓濃縮至相對密度約為1.24 g／mL，取適量糊精，以75%乙醇為黏合劑，采用濕法制粒，干燥得顆粒 30.3 kg，共 3批(批號分別為 20180915，20180916，20180917)。試驗結(jié)果見表 7。

表7 3批樣品中試數(shù)據(jù)結(jié)果

2.4 淫羊藿苷量值傳遞

精密稱取飲片 0.5 g，按 2015年版《中國藥典(一部)》淫羊藿飲片含量測定項下供試品溶液制備方法制備飲片供試品溶液。精密量取3批中試提取液各20 mL，按 2.2.2項下方法制備供試品溶液。精密稱取 3批中試流浸膏各0.2 g，加入10 mL熱水，超聲處理30 min，依法制備流浸膏供試品溶液。精密稱取3批中試配方顆粒各0.2 g，加熱水10 mL，超聲處理30 min，依法制備配方顆粒供試品溶液。分別取以上供試品溶液，按2.2項下方法測定淫羊藿苷含量。結(jié)果見表8?？梢?，由飲片到配方顆粒成品，淫羊藿苷總轉(zhuǎn)移率達(dá)40%，由飲片→提取液淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率降低約30%，在煎煮過程中，損失一定量的淫羊藿苷，但在制備工藝全過程中，淫羊藿苷含量較穩(wěn)定?？梢?，淫羊藿飲片-提取液-流浸膏-配方顆粒間特征性成分的量值傳遞一致性較好。

表8 淫羊藿苷 中間體 配方顆粒指標(biāo)成分量值傳遞結(jié)果（%）

3 討論

參考2015年版《中國藥典(一部)》淫羊藿的評價指標(biāo)，并分析飲片-提取液-流浸膏-配方顆粒間的量值傳遞，確定以淫羊藿苷作為配方顆粒質(zhì)控指標(biāo)。本試驗中對比淀粉、糊精2種輔料的流動性及成型性，結(jié)果表明，糊精比淀粉流動性、成型性好，不易吸濕，故選擇糊精作為輔料。通過多次配伍考察干粉與糊精的比例，最終確定干粉-糊精（1∶1）制粒，效果更佳。將傳統(tǒng)的中藥湯劑制備成中藥配方顆粒后，由于劑型發(fā)生改變，可能影響有效成分的量值傳遞。本研究中考察了飲片-提取液-流浸膏-配方顆粒配方成型等工藝淫羊藿苷的含量傳遞變化，求證各工藝過程中特征成分的含量及轉(zhuǎn)移率，評價配方顆粒制備工藝的均一性，為配方顆粒替代傳統(tǒng)湯劑的研究提供了思路。