天丹通絡(luò)膠囊對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及海馬區(qū)Nogo-A和LPA蛋白表達(dá)的影響

陳紅梅 ，秦碧勇 ，尤志

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000； 2.湖北省武漢市江夏第一人民醫(yī)院，湖北 武漢 430200）

急性腦梗死為常見腦血管疾病，有很高的發(fā)病率和死亡率，正在成為公共衛(wèi)生的主要挑戰(zhàn)[1]。目前，重組組織纖溶酶原是治療急性腦梗死臨床最有效的藥物，但有時(shí)間窗限制，不良反應(yīng)較多[2]。氧自由基、神經(jīng)元凋亡、興奮性氨基酸的毒性及腦組織代謝異常引起的損傷與急性腦梗死的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，氧化應(yīng)激是缺血-再灌注損傷的主要發(fā)病機(jī)制，且是導(dǎo)致腦梗死的重要原因[3]。溶血磷脂酸（LPA）是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間磷脂類信號(hào)分子，常作為體內(nèi)凝血或血栓形成啟動(dòng)的分子標(biāo)志物，其可誘導(dǎo)血小板形態(tài)改變，促進(jìn)血小板聚集和活化，而活化的血小板可釋放 LPA[4]。勿動(dòng)蛋白 -A（Nogo-A）由中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）少突膠質(zhì)細(xì)胞及一些神經(jīng)元產(chǎn)生，存在于髓鞘的內(nèi)外環(huán)和少突膠質(zhì)細(xì)胞的表面，與神經(jīng)元的存活和發(fā)育密切相關(guān)，Nogo-A及LPA的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[5]。天丹通絡(luò)膠囊主要功效為活血通絡(luò)、熄風(fēng)化痰，用于中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)、風(fēng)痰瘀血痹阻脈絡(luò)癥，見半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜、語言蹇塞，腦梗死急性期、恢復(fù)早期見上述證候[6]；具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用，其抗氧化效力是α-生育酚的500倍；毒性低和不良反應(yīng)少，是心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效治療藥物[7]。本研究中探討了天丹通絡(luò)膠囊對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及海馬區(qū)Nogo-A及LPA蛋白表達(dá)的影響，為急性腦梗死的治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：PRO-200型組織均質(zhì)器（德國默克公司），VR-98型紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司），ABIPRISM?7300型RT-qPCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）；EC3型成像系統(tǒng)（美國Upland公司）。

試藥：天丹通絡(luò)膠囊（山東鳳凰制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20010029，批號(hào)為C14001035399，規(guī)格為每粒 0.4 g）；TRIzol?（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)為 65412）；PrimeScript RT 試劑盒（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)為63541）；放射免疫沉淀測(cè)定裂解緩沖液（Pierce Rockford IL，批號(hào)為52489）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific，Inc，批號(hào)為 20154）；10%聚丙烯酰胺凝膠電泳膜（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE，Sigma，批號(hào)為12547）；聚偏二氟乙烯膜（美國賽默飛世公司，批號(hào)為 AZ5486）；TBS-T（含有 0.05%Tween-20，碧云天科技公司；批號(hào)為 1247）；Nogo-A，LPA 抗體（Cell Signaling Technology，Inc，目錄號(hào)為 2225S 和 65841，稀釋度為1∶1 000）；β-肌動(dòng)蛋白抗體（武漢博斯特生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)為 BM0627，稀釋度為1∶300）；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗（武漢博斯特生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)為GA1014，稀釋度為1∶5000）；ECL溶液（EMD Millipore，Billerica，MA，批號(hào)為 2015633）。

動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠80只，7～8周，體質(zhì)量250～280 g，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)為 SCXK（蘇）2019-0012，合格證號(hào)為 SCXK（蘇）2018-0013]。該研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物分組、造模與給藥

所有大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、模型組(B 組)、天丹通絡(luò)膠囊低劑量組（C1組，40.0 mg ／kg）、天丹通絡(luò)膠囊高劑量組（C2組，80.0 mg ／kg），每組20只，雌雄各半。各組大鼠用水合氯醛（400 mg／kg）麻醉并置背臥位，直腸溫度維持在（37.0 ± 0.5）℃，手術(shù)暴露右頸總動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，然后將頸外動(dòng)脈分離并結(jié)扎。B組、C1組、C2組將4-0尼龍縫合線通過頸外動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈，并輕輕推進(jìn)以閉塞大腦中動(dòng)脈。閉塞90 min后，小心地移除縫合線以恢復(fù)血流，閉合頸部切口，將大鼠放回溫暖的籠子中。C1組及C2組于造模成功第1天開始給予相應(yīng)劑量藥物灌胃（天丹通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，灌胃體積為每100 g體質(zhì)量1.0 mL），持續(xù)給藥3個(gè)月，A組和B組大鼠給予等體積生理鹽水。

1.3 大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)

神經(jīng)系統(tǒng)檢查：治療7 d及14 d后，以盲法進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查。使用0～5分制的神經(jīng)功能缺損評(píng)分進(jìn)行評(píng)估。0分，無神經(jīng)功能障礙癥狀；1分，前爪無法完全伸展；2分，走路時(shí)向內(nèi)旋轉(zhuǎn)；3分，走路時(shí)向內(nèi)傾斜；4分，無法自發(fā)行走和失去知覺；5分，完全無法行走。

雙側(cè)貼紙去除試驗(yàn)：動(dòng)物術(shù)后14 d，用2片邊長10 mm的正方形黏性紙將大鼠2個(gè)前肢掌面粘住（黏性程度以正常大鼠10 s內(nèi)將黏性紙咬掉為佳），將大鼠置測(cè)試圓筒中，大鼠會(huì)本能地將紙片咬掉。觀察并記錄大鼠去除兩側(cè)紙片的總時(shí)間，若120 s內(nèi)未去除紙片，記為120 s[8]。

平衡木行走試驗(yàn)：動(dòng)物術(shù)后14 d進(jìn)行。平衡木為105 cm×4 cm×3 cm木條，兩端固定使木條離地80 cm。起始點(diǎn)為陡峭平臺(tái)，終點(diǎn)為一平臺(tái)。記錄大鼠四肢均通過整個(gè)平衡木的時(shí)間；超過120 s未通過整個(gè)平衡桿記為120 s，大鼠從平衡桿跌落記為超過120 s未通過。測(cè)試前大鼠每天訓(xùn)練1次，共訓(xùn)練2 d[9]。

1.4 大鼠腦梗死結(jié)構(gòu)觀察

大體標(biāo)本觀察：造模后1 h直接取腦，觀察創(chuàng)傷區(qū)病理改變。鼠腦經(jīng)-80℃冰箱速凍后，切取厚2 mm創(chuàng)傷區(qū)冠狀腦片，觀察冠狀剖面腦組織病理變化。

HE染色觀察：造模后1 d灌注取腦，常規(guī)制作厚6 μm石蠟切片，按照產(chǎn)品說明書行HE染色，10倍及200倍顯微鏡下觀察創(chuàng)傷區(qū)病理變化。

1.5 大鼠海馬組織Nogo-A及LPA基因水平檢測(cè)

從海馬標(biāo)本中總共獲得100 g組織，添加1 mL TRIzol?并與組織均質(zhì)器混合攪拌，根據(jù)制造商的規(guī)程提取總RNA。使用VR-98型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度，并使用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。轉(zhuǎn)錄合成的cDNA產(chǎn)物儲(chǔ)存在-20℃下供以后使用。Nogo-A，LPA，GAPDH引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司提供。GAPDH被用作參考基因，各引物序列如下。Nogo-A：正向5′-CCCGTGTCGACGATGTAGCGCTAGA-3′，反 向 5′-TCGTAGCTATGCGATACGTACACAAC-3′；LPA：正向 5′-CTAGTAGCTAGAAAGTCGCCTAAACGTG-3， 反 向 5′-CTAGTCAATGCTAGCTTCGTTGTGACCCGTAGTAGCTGA-3；GADPH：正向 5′-CTAGAGGGGAAATCCTATCGATGACATAGTCAG-3， 反 向 5′-CTGACGTAGCTTGAACTGATGCTAGCTTCGTTGTCTGATGCTGAT-3。使用 RT-qPCR系統(tǒng)檢測(cè)Nogo-A和LPA mRNA的表達(dá)。RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25 μL，熱循環(huán)儀條件如下：50℃ 2 min，95℃ Taq酶活化 10 min，95 ℃ 15 s，然后60 ℃ 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCq方法用于證明 Nogo-A和LPA的相對(duì)表達(dá)。

1.6 大鼠腦梗死海馬組織Nogo-A和LPA蛋白檢測(cè)

使用放射免疫沉淀測(cè)定裂解緩沖液提取海馬組織總蛋白樣品，并使用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白質(zhì)（每泳道100 ng蛋白質(zhì)）通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳膜分離，使用濕化學(xué)法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并在室溫下與5%脫脂奶粉一起攪拌并封閉2 h；將膜用TBS-T洗滌3次，然后與Nogo-A及LPA抗體或β-肌動(dòng)蛋白抗體在4℃下過夜。用TBS-T洗滌后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗一起在室溫下孵育1 h；此后，使用ECL溶液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，并使用EC3成像系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行可視化，并通過灰度定量使用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）進(jìn)行分析。重復(fù)操作3遍。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

治療7，14 d后，B組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間明顯高于A組（P＜0.05）；C1組及 C2組上述指標(biāo)均明顯低于 B組（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加，7d和14 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分、雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間均逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的比較（±s，n＝20）

表1 各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的比較（±s，n＝20）

注：與 A 組比較, P ＜0.05；與 B 組比較,＃P ＜0.05；與 C1組比較, P ＜0.05。下表同。

組別劑量（m g／k g）神經(jīng)功能缺損評(píng)分（分）A組B組C 1組C 2組4 0 8 0 7 d 0 1 0.9 6 ±0.9 6 8.4 9 ± 0.5 9 ＃6.6 9 ± 0.4 9 ＃1 4 d 0 8.4 6±0.6 2 5.6 9 ± 0.5 3 ＃4.2 6 ± 0.4 5 ＃雙側(cè)貼紙去除時(shí)間（s）2 6.5 9 ± 6.6 3 1 0 3.4 8 ±2 5.8 4 8 0.8 5 ± 8.2 3 ＃5 1.4 2 ± 9.2 5 ＃平衡木過桿時(shí)間（s）1.8 9 ±0.3 9 1 6.4 8 ±6.6 3 1 2.5 9 ±0.7 4 ＃8.7 6 ±0.6 3 ＃

2.2 大鼠腦梗死海馬結(jié)構(gòu)

結(jié)果見圖1?？梢?，A組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞正常，B組海馬組織見大量壞死神經(jīng)元，呈缺血樣病理改變，空泡樣變性壞死數(shù)量較多；C2組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞壞死有明顯改善；C1組神經(jīng)元疏松紊亂，但壞死神經(jīng)元細(xì)胞減少。

圖1 天丹通絡(luò)膠囊對(duì)大鼠海馬結(jié)構(gòu)的影響（HE，×200）

2.3 大鼠海馬Nogo-A及LPA的mRNA和蛋白表達(dá)

B組海馬Nogo-A和LPA的mRNA表達(dá)水平明顯高于 A 組（P ＜0.05）；C1組及 C2組海馬 Nogo-A 和LPA mRNA表達(dá)水平明顯均低于A組（P＜0.05），且隨著天丹通絡(luò)膠囊給藥劑量的增加而逐漸降低（P＜0.05）。B組海馬Nogo-A和LPA蛋白表達(dá)水平明顯高于A組（P＜0.05）；C1組及 C2組海馬 Nogo-A 和 LPA 蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加而逐漸降低（P＜0.05）。詳見表2及圖2。

表2 天丹通絡(luò)膠囊對(duì)急性腦梗死大鼠海馬Nogo-A及LPA的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n＝20）

表2 天丹通絡(luò)膠囊對(duì)急性腦梗死大鼠海馬Nogo-A及LPA的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n＝20）

組別劑量（m g／k g）N o g o-A m R N A L P A m R N A N o g o-A蛋白L P A蛋白A組B組C 1組C 2組4 0 8 0 1.5 2 ±0.4 1 6.9 6 ±0.3 9 5.4 1 ±0.5 4 ＃2.2 6 ±0.4 9 ＃1.6 9 ± 0.4 8 5.9 9 ± 0.5 9 4.1 2 ± 0.5 9 ＃2.1 5 ± 0.5 1 ＃0.8 9 ±0.3 6 6.6 2 ±0.3 9 5.9 6 ±0.4 8 ＃2.1 4 ±0.5 3 ＃1.2 9 ±0.4 7 6.4 8 ±0.5 9 4.9 9 ±0.4 2 ＃2.2 6 ±0.6 9 ＃

圖2 天丹通絡(luò)膠囊對(duì)急性腦梗死大鼠海馬Nogo-A和LPA蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

急性腦梗死的病理基礎(chǔ)為腦組織發(fā)生急性缺血，局灶性腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血腦屏障功能喪失，腦細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和壞死。天丹通絡(luò)膠囊有抑制腦水腫、抗氧化應(yīng)激損傷和調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)生長因子（NGF）表達(dá)的作用[10]。本研究結(jié)果顯示，B組7 d和14 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分、雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間明顯高于A組，表明大鼠急性腦梗死模型建立成功，而天丹通絡(luò)膠囊可明顯降低7 d和14 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分、雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間，表明天丹通絡(luò)膠囊對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損有保護(hù)作用。

藥理學(xué)研究顯示，天丹通絡(luò)膠囊可抑制大鼠血小板聚集，促進(jìn)已聚集的血小板解聚；可延長凝血酶原、凝血酶和白陶土部分凝血活酶時(shí)間，使大鼠凝血時(shí)間延長；縮短大鼠優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間；改善肌肉注射地塞米松磷酸鈉引起的激素性血瘀大鼠全血黏度；可延長電流刺激所致大鼠動(dòng)脈血栓形成的時(shí)間；降低結(jié)扎頸總動(dòng)脈所致的急性腦缺血大鼠腦血管的通透性和腦組織的含水量；減輕電熱阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈所致腦缺血病變的程度[11]。本研究結(jié)果顯示，B組腦梗死組織見大量壞死神經(jīng)元，呈缺血樣病理改變，空泡樣變性壞死數(shù)量較多；C2組腦組織神經(jīng)細(xì)胞壞死有明顯改善；C1組神經(jīng)元疏松紊亂，但壞死神經(jīng)元細(xì)胞減少，表明天丹通絡(luò)膠囊能明顯減少神經(jīng)元細(xì)胞壞死。

腦梗死急性期，缺血區(qū)域中央帶的神經(jīng)元在幾分鐘內(nèi)會(huì)發(fā)生不可逆壞死，出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和生物學(xué)功能喪失。故細(xì)胞凋亡在急性腦梗死的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。研究表明，Nogo-A可與凋亡途徑中的某些保守成分，即半胱天冬酶（Caspase）反應(yīng)[12]，可直接促進(jìn) Caspase 活化。Caspase 也是細(xì)胞凋亡途徑的中心環(huán)節(jié)。Nogo-A還可促進(jìn)哺乳動(dòng)物中 Caspase-1，Caspase-3，Caspase-6，Caspase-7，Caspase-8，Caspase-10的活化。Nogo-A在神經(jīng)細(xì)胞表面相互作用，并參與受體和線粒體的凋亡途徑?；诖?，抑制Nogo-A的激活可能是腦梗死的重要治療靶點(diǎn)。LPA在毛細(xì)血管附近的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突和室管膜細(xì)胞中組成性表達(dá)，通過充當(dāng)血腦屏障（BBB）和血腦脊液屏障的關(guān)鍵成分來調(diào)節(jié)腦脊液穩(wěn)態(tài)[13]。在缺氧和局部缺血中，血腦屏障的破壞和血管通透性的增加與大腦中LPA的上調(diào)有關(guān)。LPA在腦缺血中上調(diào)，并與血腦屏障破壞、水腫形成和出血性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。在急性腦缺血中，血腦屏障破壞與LPA的表達(dá)上調(diào)相關(guān)，可能加劇神經(jīng)元損傷和治療后的出血性轉(zhuǎn)化。活化的LPA可直接破壞神經(jīng)血管基質(zhì)，如緊密連接蛋白（ZO-1，claudin-5，occcludin）和基底層（膠原蛋白Ⅳ，層黏連蛋白和纖連蛋白），并導(dǎo)致血腦屏障分解最終出血和水腫。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，降低了活性LPA的上調(diào)，血腦屏障出血減少，進(jìn)而減少腦梗死的發(fā)生[14]。本研究結(jié)果顯示，天丹通絡(luò)膠囊明顯降低了腦梗死海馬區(qū)Nogo-A及LPA的mRNA和蛋白表達(dá)水平。表明天丹通絡(luò)膠囊可能通過抑制腦梗死海馬區(qū)Nogo-A及LPA的mRNA和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制神經(jīng)元細(xì)胞的壞死與凋亡。

綜上所述，天丹通絡(luò)膠囊對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損有防護(hù)作用；其作用機(jī)制可能與天丹通絡(luò)膠囊通過抑制腦梗死海馬區(qū)Nogo-A及LPA的mRNA和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制了神經(jīng)元細(xì)胞的壞死與凋亡有關(guān)。