番茄紅素對膿毒癥大鼠免疫及炎性因子的影響

王 涵，伍志超

（四川省南充市中心醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000）

膿毒癥是由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS），發(fā)病率高，病死率高，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能不全綜合征（MODS），進(jìn)而危及生命[1-2]。免疫細(xì)胞功能紊亂和炎性細(xì)胞因子失衡在膿毒血癥器官損傷中扮演重要角色，并影響預(yù)后[3]。番茄紅素具有清除自由基、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分泌等多種藥理活性[4]，可減輕膿毒血癥大鼠心肌纖維損傷，維持內(nèi)皮系統(tǒng)平衡[5]。本研究中探討了番茄紅素對膿毒癥大鼠免疫及炎性細(xì)胞因子的影響，為臨床治療膿毒癥提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：T12MM型離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；Gallios型流式細(xì)胞儀（中國貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；乙醇（北京華阜康生物科技股份有限公司）；二甲苯（湖北廣奧生物科技有限公司）；蘇木素、伊紅（上海源葉生物科技有限公司）；中性樹膠封片劑（美國National Diagnotics公司）；Ni Ci E100 E200型顯微鏡（上海千欣儀器有限公司）；IL-6測定試劑盒(北京冬歌生物科技有限公司)；TNF-α測定試劑盒(深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司)；MDA測定試劑盒(上海創(chuàng)賽科技有限公司)；SOD測定試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)。

試藥：戊巴比妥鈉（天津興隆化學(xué)制藥廠）；生理鹽水（江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司）；內(nèi)毒素（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）。

動物：SD大鼠30只，SPF級，健康，雄性，周齡8～10周，體質(zhì)量（280±20）g，購于上海靈暢生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0003。喂養(yǎng)于動物實驗室獨立通氣籠中（每籠5只），室溫維持在22～25℃，相對濕度維持在50% ～60%，所有大鼠每天接受12 h光照，采用同種無菌飼料投喂，不限制飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 分組、造模及處理

將30只SD大鼠分為對照組、模型組、處理組，每組10只。各組大鼠腹腔注射45 mg／kg戊巴比妥鈉予以麻醉，處理組尾靜脈注射50 mg／kg番茄紅素[5]，對照組及模型組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，2 h后模型組及處理組大鼠腹腔注射20 mg／kg內(nèi)毒素（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司），對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模成功標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]。

1.3 觀察指標(biāo)

白細(xì)胞介素 6（IL-6）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平：注射 6 h后采集各組大鼠外周靜脈血4 mL，置T12MM型離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司），3 000 r／min離心20 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組大鼠血清中的IL-6和TNF-α含量，采用硫代巴比妥酸法檢測血清MDA水平，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平。

免疫細(xì)胞數(shù)量：采集3組大鼠外周血各2 mL，用肝素抗凝，采用流式細(xì)胞儀檢測外周血中 CD3+，CD8+，CD4+T細(xì)胞百分比。

肺組織病理變化：3組大鼠采血后，將其處死，取肺組織，10%甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋成塊，切成5 μm連續(xù)切片，脫蠟水化，蘇木素染色，流水沖洗，伊紅染色，流水沖洗，烤片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片劑封片，顯微鏡觀察蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。各組大鼠外周血中 CD3+，CD8+，CD4+T 細(xì)胞百分比及 IL-6，TNF-α，SOD，MDA水平比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化

對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡間隔正常，肺間質(zhì)無充血水腫，無中性粒細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增寬，肺間質(zhì)有明顯充血水腫，部分肺不張，有大量中性粒細(xì)胞浸潤；處理組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)充血水腫明顯改善，中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少。模型組較對照組肺組織病理損傷明顯，處理組較模型組肺組織病理改善明顯。詳見圖1。

2.2 外周血檢測指標(biāo)

結(jié)果見表1。

圖1 3組大鼠肺組織病理變化（HE染色，×200）

表1 3組大鼠外周血中免疫細(xì)胞數(shù)量、炎性因子含量、SOD及MDA水平比較（±s，n＝10）

表1 3組大鼠外周血中免疫細(xì)胞數(shù)量、炎性因子含量、SOD及MDA水平比較（±s，n＝10）

注：與對照組相比， P ＜0.05；與模型組相比， P ＜0.05。

組別對照組模型組處理組C D 3+T細(xì)胞（%）3 7.2 5 ± 6.9 8 2 7.0 9 ± 6.0 2 3 4.1 2 ± 6.1 3 C D 4+T細(xì)胞(%)1 9.8 8 ± 1.4 5 2 5.3 2 ± 2.0 5 2 2.1 1 ± 1.8 7 C D 8+T細(xì)胞(%)1 6.7 7 ± 6.6 5 1 0.2 3 ± 4.8 6 1 4.4 6 ± 5.5 6 I L-6(n g／m L)2 6.3 8 ± 2.3 1 3 3.0 2 ± 3.0 5 2 8.1 1 ± 2.5 2 T N F- (n g／m L)1 9 5.7 0 ±1 0.9 7 2 3 0.8 9 ±1 8.4 5 2 0 1.3 2 ±1 1.0 9 S O D（U ／m L）1 8 3.5 5 ± 1 3.5 7 1 3 2.1 9 ± 1 0.2 3 1 6 8.1 2 ± 1 2.4 1 M D A（n m o l／m L）4.1 1 ± 0.7 0 1 0.8 3 ± 1.6 8 7.2 2 ± 1.3 1

3 討論

膿毒癥為重癥監(jiān)護(hù)病房常見危重癥，常見于多發(fā)傷、嚴(yán)重?zé)齻⒅匕Y肺炎、外科手術(shù)等患者，也可見于再生障礙性貧血、白血病、糖尿病、慢性阻塞性支氣管炎、尿路結(jié)石等慢性疾病患者[6]。70%的膿毒癥患者早期表現(xiàn)為意識狀態(tài)改變、低血壓、組織灌注不良等休克癥狀，隨著病情進(jìn)展可導(dǎo)致MODS[2]。全身炎性反應(yīng)與代償性抗炎反應(yīng)協(xié)調(diào)失衡是發(fā)病的核心機制[3]，故尋找一種能有效調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子失衡的物質(zhì)對于控制膿毒癥病情具有重要意義。

番茄紅素是一種天然的紅色開鏈烴類胡蘿卜素，由11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵組成，目前主要通過植物提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵獲得，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、提高免疫力、保護(hù)心腦血管等作用[4]。番茄紅素與急性心肌梗死及心源性猝死相關(guān)[7]；能修復(fù)受損衰老的胰島細(xì)胞，促使胰島素正常分泌[8]；能增強小鼠單核巨噬細(xì)胞作用及體液免疫和細(xì)胞免疫功能[9]。

T淋巴細(xì)胞亞群測定有助于了解機體免疫狀況及病情監(jiān)測，CD3+反映總T細(xì)胞，通過鹽橋與T細(xì)胞抗原受體相連，進(jìn)而參與T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]；CD4+主要表達(dá)于輔助T細(xì)胞，輔助T細(xì)胞免疫效應(yīng)，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體，調(diào)節(jié)殺傷淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等活性[11]；CD8+主要為細(xì)胞毒T細(xì)胞亞群，主要分布于抑制性和殺傷性T淋巴細(xì)胞表面，抑制B淋巴細(xì)胞功能，還對細(xì)胞內(nèi)寄生生物感染的靶細(xì)胞有殺傷作用[12]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，處理組大鼠外周血中CD4+T細(xì)胞百分比顯著降低，CD3+，CD8+T細(xì)胞百分比顯著升高，表明番茄紅素在膿毒癥發(fā)病過程中對機體免疫功能異常改變的作用不明顯，這可能是由于番茄紅素在大鼠體內(nèi)作用時間較短，其作用尚未體現(xiàn)的原因。

IL-6和TNF-α為誘導(dǎo)機體炎性反應(yīng)的重要炎性因子，在炎癥發(fā)生時，其在血液中的水平迅速發(fā)生改變。TNF-α是一種單核因子，主要產(chǎn)生于巨噬細(xì)胞，具有參與局部炎癥、殺傷靶細(xì)胞、調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞活化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[13]。IL-6是由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，能增強NK細(xì)胞裂解功能，使B細(xì)胞前體成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞[14-15]。本研究結(jié)果顯示，處理組大鼠外周血中IL-6及TNF-α水平均顯著低于模型組；處理組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡間隔、肺間質(zhì)充血水腫、中性粒細(xì)胞浸潤較模型組均有明顯改善，表明番茄紅素能有效降低炎性細(xì)胞因子水平，減輕膿毒癥大鼠肺組織病理損傷。

膿毒血癥釋放的內(nèi)毒素可增加活性氧及自由基產(chǎn)生，而活性氧及自由基產(chǎn)生是膿毒血癥致肺損傷的重要環(huán)節(jié)。同時，內(nèi)毒素引起的炎性反應(yīng)可誘發(fā)氧化應(yīng)激，可進(jìn)一步加強炎性反應(yīng)，從而使免疫細(xì)胞比例紊亂和炎性細(xì)胞因子失衡得不到控制[5]。因此，提高機體抗氧化能力有助于改善機體炎癥。本研究結(jié)果顯示，處理組大鼠外周血中MDA水平顯著低于模型組，但SOD水平顯著高于模型組，表明抗氧化作用最強的類胡蘿卜素-番茄紅素可有效降低內(nèi)毒素引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低炎性反應(yīng)，并減輕組織損傷。

綜上所述，番茄紅素能有效降低膿毒癥大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，減輕肺組織病理損傷，但其在膿毒癥發(fā)病過程中對機體免疫功能異常改變的作用不明顯，且番茄紅素為預(yù)先注入大鼠體內(nèi)，因此番茄紅素在膿毒癥發(fā)病過程中對機體免疫功能的作用機制有待進(jìn)一步研究。