鹽酸戊乙奎醚誘導(dǎo)早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1的表達(dá)及其對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用

陳 曦，胡婷婷，史惠卿，劉小娟，李 楠

（中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，四川 成都 610083）

早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白 1（EGR1）屬即刻早期基因家族、編碼cys2-his2型鋅指蛋白，廣泛表達(dá)于從酵母到人類的真核細(xì)胞中[1]。作為轉(zhuǎn)錄因子的EGR1，能與多種下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，調(diào)控許多基因的表達(dá)，這些基因參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、缺氧反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)[2-3]，有的甚至在腫瘤中發(fā)揮重要作用[4-5]。EGR1是表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）介導(dǎo)的腦室區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞在缺氧-低血糖恢復(fù)期擴(kuò)增的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]。DICKINSON等[7]的研究顯示，EGR1能促進(jìn)血管表皮細(xì)胞的增殖，但EGR1通過(guò)何種基因影響細(xì)胞的增殖仍有待進(jìn)一步研究。本研究中探討了EGR1在人類血管平滑肌細(xì)胞(CRL-1999)增殖過(guò)程中的作用及影響的下游基因，旨在揭示其在肺血管損傷修復(fù)中的作用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

細(xì)胞株：CRL-1999購(gòu)于ATCC。

試劑：F-12K營(yíng)養(yǎng)混合物培養(yǎng)基，胎牛血清，均購(gòu)自Gibco公司；抗人EGR1抗體（Santa公司）；抗人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白D1（CCND1）抗體，抗人細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1／2（ERK1／2）抗體，抗人磷酸化的 ERK1／2（p-ERK1／2）抗體，均購(gòu)自 CST公司；辣根氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔，山羊抗鼠二抗，均購(gòu)自博奧生物公司）；RIPA裂解液；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒，5% ～20%梯度預(yù)制膠，電泳液，轉(zhuǎn)膜液及蛋白彩色預(yù)染MARKER、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，均購(gòu)自碧云天公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）試劑盒，均購(gòu)自日本Takara公司；慢病毒購(gòu)自吉?jiǎng)P生物公司；EDU檢測(cè)試劑盒（iClickTM EdU Andy Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit，廣東復(fù)能基因有限公司)。

儀器：7500型 Real-Time PCR System PCR儀（美國(guó)ABI公司）；Fluor Chem型凝膠成像化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple公司）；Gallios型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：取CRL-1999細(xì)胞，置含10%胎牛血清的F-12K營(yíng)養(yǎng)混合物培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞慢病毒干擾實(shí)驗(yàn)：取10×104個(gè)／孔對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，置12孔板中，過(guò)夜貼壁培養(yǎng)。按感染復(fù)數(shù)(MOI)為30的量加入慢病毒，培養(yǎng)12 h后，換成新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h，然后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

qRT-PCR：采用Trizol法分別提取siEGR1-CRL-1999細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR PCR試劑盒在7500型Real-Time PCR System RCR儀上進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)（預(yù)變性，95 ℃ 30 s，然后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)），設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔。PCR引物：ACTIN，正向引物 5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，反向引物 5′-GTAGTTTC GTGGATGCCACAG-3′；EGR1，正向引物 5′-CAGCAC CTTCAACCCTCAG-3′，反向引物 5′-CACAAGGTGTT GCCACTGTT-3′；CCND1，正向引物 5′-TATTGCGCTGCTACCGTTGA-3′，反向引物 5′-CCAATAGCAGCAA ACAATGTGAAA-3′。

蛋白質(zhì)印跡（WB）法檢測(cè) EGR1，CCND1，ERK1 ／2和p-ERK1／2蛋白表達(dá)：采用RIPA裂解液法提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，沸水煮5 min使蛋白變性；蛋白上樣量為40 μg，以5%～20% 梯度膠電泳分離蛋白質(zhì)；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏乙烯（PVDF）膜，5%BSA封閉1 h，加入一抗4℃過(guò)夜（EGR1 1 ∶1 000，ACTIN 1 ∶2 000，CCND1 1 ∶1 000，ERK1 ／2 1 ∶1 000，p-ERK1 ／2 1 ∶1 000），二抗室溫孵育 1 h（山羊抗鼠 1∶5 000，山羊抗兔 1∶5 000），采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。

EDU法檢測(cè)細(xì)胞增殖：分別用胰酶消化對(duì)照組細(xì)胞和 siEGR1-CRL-1999細(xì)胞，計(jì)數(shù)，2×105個(gè) ／孔接種于6孔板內(nèi)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基，每孔加入2 mL含 10 μmol／mL EDU 的培養(yǎng)液，37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，按試劑盒說(shuō)明處理細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀分析。

鹽酸戊乙奎醚處理細(xì)胞：將CRL-1999細(xì)胞和siEGR1-CRL-1999細(xì)胞按 5×105個(gè)／孔接種于 6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，然后加入鹽酸戊乙奎醚，并設(shè)空白對(duì)照組，最終質(zhì)量濃度為2 μg／mL。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并于0，0.5，1，2，4，8 h 時(shí)取材備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料（正態(tài)分布）以±s表示，組內(nèi)兩兩比較行 t檢驗(yàn)；采用相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，r＜0.3為低度正相關(guān)，0.3≤r＜0.7 為中度正相關(guān)，0.7≤ r＜ 1.0 為高度正相關(guān)；統(tǒng)計(jì)圖表采用GraphPad Prism 6繪制。P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒對(duì)CRL-1999細(xì)胞中EGR1表達(dá)水平的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGR1干擾慢病毒48 h后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞都表現(xiàn)出明顯的綠色熒光（見(jiàn)圖1 A），表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染了慢病毒，并整合到基因組上，成功構(gòu)建siEGR1-CRL-1999細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示，EGR1被成功干擾（見(jiàn)圖 1 B，P ＜0.01）。同時(shí)，WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGR1蛋白表達(dá)水平也明顯降低（見(jiàn)圖1 C）。

圖1 慢病毒對(duì)CRL-1999細(xì)胞中EGR1表達(dá)水平的影響

2.2 敲低EGR1表達(dá)對(duì)CRL-1999細(xì)胞增殖的影響

將EDU加入siEGR1-CRL-1999細(xì)胞或?qū)φ战M細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后，陰性對(duì)照組中26%的細(xì)胞含有EDU，即26%的細(xì)胞進(jìn)入了S期；同時(shí)，siEGR1-CRL-1999細(xì)胞中只有19%的細(xì)胞含有EDU，其增殖效率減少了 27% （見(jiàn)圖 2，P ＜ 0.01）。表明干擾 EGR1 后，CRL-1999細(xì)胞增殖受到了明顯抑制。

圖2 敲低EGR1表達(dá)對(duì)CRL-1999細(xì)胞增殖的影響

2.3 敲低EGR1表達(dá)對(duì)CCND1表達(dá)水平的影響

敲低 EGR1后，qRT-PCR結(jié)果表明，CCND1的表達(dá)相應(yīng)降低（見(jiàn)圖 3A，***P ＝0.0003，**P ＝0.001 1）。WB實(shí)驗(yàn)也表明，敲低CRL-1999細(xì)胞的EGR1后，CCND1蛋白表達(dá)水平明顯降低（見(jiàn)圖3 B）。

圖3 敲低EGR1表達(dá)對(duì)CCND1表達(dá)水平的影響

2.4 鹽酸戊乙奎醚對(duì)EGR1表達(dá)水平的影響

對(duì)CRL-1999細(xì)胞進(jìn)行鹽酸戊乙奎醚處理，分別在 0 h（處理前），及處理后 0.5，1，2，4，8 h 時(shí)提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行WB檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)處理1 h后EGR1蛋白表達(dá)開(kāi)始增多，2 h時(shí)達(dá)頂點(diǎn)，一直持續(xù)到8 h時(shí)（見(jiàn)圖4 A），表明鹽酸戊乙奎醚能誘導(dǎo)CRL-1999細(xì)胞的EGR1表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)siEGR1-CRL-1999細(xì)胞和CRL-1999細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行鹽酸戊乙奎醚處理，并進(jìn)行WB檢測(cè)。處理4 h后，鹽酸戊乙奎醚處理組的CRL-1999細(xì)胞和 siEGR1-CRL-1999 細(xì)胞的（b，d）EGR1 蛋白表達(dá)量均比未處理組（a，c）增多，且藥物誘導(dǎo)后的siEGR1-CRL-1999細(xì)胞（d）的EGR1蛋白表達(dá)量顯著低于CRL-1999細(xì)胞（b），進(jìn)一步表明鹽酸戊乙奎醚能誘導(dǎo)CRL-1999細(xì)胞的EGR1表達(dá)（見(jiàn)圖4 B）。

圖4 鹽酸戊乙奎醚對(duì)EGR1表達(dá)水平的影響

2.5 鹽酸戊乙奎醚可通過(guò)ERK1／2通路刺激EGR1表達(dá)

對(duì)2.4項(xiàng)下不同時(shí)間點(diǎn)提取的蛋白質(zhì)中p-ERK1／2，ERK1／2和EGR1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，p-ERK1／2在鹽酸戊乙奎醚處理1 h后表達(dá)水平達(dá)峰值，維持至2 h時(shí)，隨后逐漸減少。而EGR1的表達(dá)在1 h時(shí)僅輕微增多，后逐漸增多，其蛋白水平表達(dá)變化在時(shí)間上總落后于 p-ERK1／2（見(jiàn)圖5），提示鹽酸戊乙奎醚可通過(guò)ERK1／2通路誘導(dǎo)EGR1的表達(dá)。

圖5 加入鹽酸戊乙奎醚后，不同時(shí)間點(diǎn)p-ERK1／2，EGR1蛋白表達(dá)水平

3 討論

通常血管平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈中膜中維持非增殖狀態(tài)，但在損傷或其他刺激下，中膜的血管平滑肌細(xì)胞會(huì)遷移到內(nèi)膜，開(kāi)始增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜擴(kuò)張，即新內(nèi)膜形成[8]。富含絲／精氨酸剪輯因子1（SRSF1）能通過(guò) Δ133p53-EGR1復(fù)合體，影響KLF5的表達(dá)，從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖[9]。XIE等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，EGR-1參與了瘦素誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）的減少和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。SYSOL等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）通過(guò) EGR-1 誘導(dǎo)鞘氨醇激酶 1（SphK1）的表達(dá)，可促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。此外，在其他組織中，EGR1也起到了促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，如肌肉衍生的衛(wèi)星細(xì)胞[12]、小鼠肝臟細(xì)胞[13]等。EGR1除了能被生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)高表達(dá)外，也能被一些刺激誘導(dǎo)高表達(dá)，如缺氧、輻照等；缺氧情況下，會(huì)對(duì)肺動(dòng)脈造成一定程度損傷，故進(jìn)一步研究EGR1的功能，不但能在損傷修復(fù)階段起作用，而且在損傷防治階段也能起到一定作用。

阿魏酸通過(guò)缺氧上調(diào)EGR1來(lái)改善人肌腱衍生干細(xì)胞的自我更新和分化[14]。CHEN等[15]的研究結(jié)果證實(shí)，CCND1的轉(zhuǎn)錄是由EGR1直接調(diào)控的，CCND1是3種非連接蛋白（Cyclin D1，D2，D3）之一，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中主要調(diào)控G1期向S期過(guò)渡。敲低CRL-1999細(xì)胞的EGR1后，會(huì)影響CCND1的表達(dá)，從而影響人血管平滑肌細(xì)胞CRL-1999的體外增殖。

鹽酸戊乙奎醚是我國(guó)自主研發(fā)的抗膽堿Ⅰ類新藥，有較強(qiáng)的抗M和N樣受體作用，對(duì)外周神經(jīng)有較強(qiáng)的抗M樣作用和一定程度的抗N樣作用，臨床主要用于對(duì)抗有機(jī)磷的中毒和全身麻醉患者術(shù)前給藥。鹽酸戊乙奎醚能較早改善氧合，減緩急性肺損傷的進(jìn)展，可應(yīng)用于對(duì)創(chuàng)傷性急性肺損傷早期的干預(yù)治療[16]。鹽酸戊乙奎醚能抑制炎性反應(yīng)，減輕肺組織的損傷，改善氧合，能有效緩解多發(fā)傷導(dǎo)致的急性肺損傷[17]，但其具體作用機(jī)制和通路仍不清楚。ZHANG等[18]的研究認(rèn)為，在缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷中，通過(guò)適當(dāng)增加自噬可起到保護(hù)作用，同時(shí) ERK1／2信號(hào)通路具有積極的調(diào)節(jié)作用。ERK1／2是20世紀(jì)80年代末期發(fā)現(xiàn)的一類絲／蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的一個(gè)重要亞族，正常定位于胞漿，當(dāng)激活后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。本研究中發(fā)現(xiàn)鹽酸戊乙奎醚能通過(guò)ERK1／2通路刺激EGR1的表達(dá)，但鹽酸戊乙奎醚通過(guò)EGR1影響血管平滑肌細(xì)胞的具體作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。