淫羊藿苷調節(jié)大鼠腦內N-甲基-D-天冬氨酸受體分子機制研究

陳 靜，高 瑜，夏海建，黃富宏，王蓓蓓

（揚州大學附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇 揚州 225001）

精神分裂癥是由一組癥狀群所組成的臨床綜合征，其破壞性嚴重[1]。中樞神經系統(tǒng)谷氨酸，尤其是N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）系統(tǒng)功能低下是精神分裂癥的病因之一[2]。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿的全草，是一種補益中藥。淫羊藿苷是其主要活性成分，可改善NMDA系統(tǒng)功能低下的精神分裂癥動物的異常行為[3]。但淫羊藿苷調節(jié)NMDA系統(tǒng)的分子機制未見報道。腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）是由BDNF基因編碼在腦內合成的一種具有神經營養(yǎng)作用的蛋白質，廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)內，在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用。BDNF基因也是精神分裂癥致病基因之一，主要表現(xiàn)精神分裂癥患者體內BDNF的表達發(fā)生異常[4-6]。以淫羊藿為主藥的中藥方劑可治療精神分裂癥，并調節(jié)海馬體內BDNF的表達[7-10]。同時，淫羊藿苷對中樞神經中BDNF mRNA的表達具有調節(jié)作用[11]。BDNF可通過自分泌，與細胞膜上的TrkB受體結合，并激活TrkB受體。激活的TrkB受體可活化下游蛋白磷脂酶 Cγ（PLCγ）[12]；激活的 PLCγ使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解產生二酰甘油（DAG），DAG 進一步激活蛋白激酶 Cδ（PKCδ）；PKCδ 通過活化 Ras蛋白激活Raf-1，進一步激活其下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPKK或MEK）及胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）。而ERK的激活可上調NMDA受體NR1亞基的活性[13]。本研究中應用NMDA受體拮抗劑MK-801構建精神分裂癥動物模型[14]，探討了淫羊藿苷對BDNF／TrkB介導的PKC／Raf-1／ERK信號通路的調節(jié)作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：CM1950型冰凍切片機（德國 Leica Biosystems公司）。

試藥：MK-801（M107），5% 小牛血清蛋白（BSA，批號為 B2064），利培酮(批號為 PHR1631)，均購自美國Sigma-Aldrich 公司；anti-BDNF（批號為 ab108319），anti-TrkB（批 號 為 ab18987），anti-Raf-1（批 號 為ab137435），anti-NMDA NR1（批號為 ab109182），均購自英國 Abcam 公司；anti-PKCδ（批號為＃2058），Anti-ERK1 ／2（批號為＃4696），β -actin（批號為＃3700，1 ∶5 000），均購自美國 Cell Signal公司；NP40 裂解液（碧云天生物技術公司，批號為P0013F）；SDS-PAGE電泳凝膠（批號為 1656020），PVDF 膜（批號為 1620177），均購自美國Bio-Rad公司；淫羊藿苷（南京本草益康生物科技有限公司）[11]。

動物：SPF級健康雄性SD大鼠24只，4周齡，體質量90～110 g，購自南京青龍山動物養(yǎng)殖中心，實驗動物使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0044，動物實驗證書編號為2150541。

1.2 方法

精神分裂癥模型的構建：采用MK-801制備精神分裂癥動物模型。選取大鼠24只，清潔飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在 21～24℃，12 h 晝夜節(jié)律（8：00～20：00），自由進食和飲水。將MK-801溶于生理鹽水中，腹腔注射，每日1次，劑量為0.2 mg／kg；空白對照組注射生理鹽水；所有動物接受連續(xù)2周的MK-801或生理鹽水注射。

實驗分組與給藥：MK-801處理后，動物行為異常（尤其是認知障礙和空間記憶障礙）可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月[15]，故MK-801動物模型構建完成后，對大鼠使用藥物。將MK-801處理的大鼠隨機分為模型組、藥物組（淫羊藿苷組）和陽性對照組（利培酮組），每組6只。將相應藥物混入糖丸（含玉米粉40%、白砂糖40%、全脂奶粉18%、明膠2%），喂飼大鼠，1日3次，每8 h 1次。對照組喂飼不含藥物的糖丸；模型組喂飼不含藥物的糖丸；藥物組喂飼含淫羊藿苷[30 mg／(kg·d）][11]的糖丸；陽性對照組喂飼含利培酮[0.3 mg／(kg·d）]的糖丸。連續(xù)喂飼1周。

蛋白質印跡(WB)法檢測蛋白質的表達：采用冰凍切片法切取大鼠海馬體組織，在冰凍切片機上切成500 μm厚度的切片，再對照腦圖譜[16]切取海馬體。加入含蛋白酶抑制劑的NP40裂解液勻漿腦組織。勻漿后的組織加熱變性，以每孔 10 μg蛋白上樣，進行 SDSPAGE電泳，電泳結束后轉至PVDF膜上，5%小牛血清蛋白（BSA）于室溫封閉1 h。再加入相應抗體，于4℃孵育，過夜。采用Bio-Rad Image Lab軟件進行灰度分析，所有實驗重復3次，以確保重復性。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用 X±SE表示，采用 SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行分析，利用Kolmogorov-Smirnov Z-test檢測數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，則利用單因素方差分析（One-way ANOVA）及 Dunnett t檢驗比較組間差異；若數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布，則使用Kruskal-Wallis H檢驗及Mann-Whiney U檢驗比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對海馬體中NMDA NR1亞體表達的調節(jié)作用

結果見圖1。MK-801模型組中，NMDA NR1亞體的表達水平顯著下降（P＜0.01）；藥物處理后，與模型組相比，MK-801導致的NMDA NR1亞體的表達水平顯著上升（P＜0.05），使其恢復至正常水平，且其效果接近利培酮（P ＜0.05）。

圖1 淫羊藿苷對NMDA受體NR1亞基表達水平的調節(jié)作用

2.2 對海馬體中BDNF表達的調節(jié)作用

結果見圖2。MK-801處理2周后可顯著降低海馬體中 BDNF的表達水平（P＜0.01）；與模型組相比，藥物處理后淫羊藿苷可顯著提升被MK-801下調的BDNF的表達水平（P＜0.05），使其恢復至接近正常水平，其效果與利培酮相似。

2.3 對海馬體中TrkB受體表達的調節(jié)作用

TrkB受體是BDNF的主要作用受體。由圖3可見，TrkB受體的表達水平在MK-801處理2周后顯著下降（P＜0.01）。與模型組相比，藥物處理后，淫羊藿苷可顯著提升被MK-801下調的TrkB受體的表達水平（P＜0.05），使其恢復至接近接近正常水平，其效果與利培酮相似。

2.4 對海馬體中PKC表達的調節(jié)作用

結果見圖4。MK-801可顯著下調PKC的表達水平（P＜0.01）。與模型組相比，藥物處理后，淫羊藿苷可顯著上調被MK-801下調的PKC表達水平（P＜0.05），其效果與利培酮相似。

圖2 淫羊藿苷對BDNF表達水平的調節(jié)作用

圖3 淫羊藿苷對TrkB受體表達水平的調節(jié)作用

2.5 對海馬體中Raf-1表達的調節(jié)作用

結果見圖5。MK-801可顯著下調Raf-1的表達水平（P＜0.01）。與模型組相比，藥物處理后，淫羊藿苷雖上調了Raf-1的表達水平，但差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.068）；而利培酮可顯著提升Raf-1的表達水平（P＜0.05）。

2.6 對海馬體中ERK1／2表達的調節(jié)作用

結果見圖6?？梢姡琈K-801可顯著下調ERK的表達水平（P＜0.01）。藥物處理后，與模型組相比，藥物組的ERK表達水平顯著上升（P＜0.05），使其恢復至接近正常水平，其效果與利培酮相似。

圖4 淫羊藿苷對PKC表達水平的調節(jié)作用

圖5 淫羊藿苷對Raf-1表達水平的調節(jié)作用

3 討論

谷氨酸受體功能低下被認為是精神分裂癥的發(fā)病機制之一。MK-801作為NMDA受體的非競爭性拮抗劑，能通過降低腦內NMDA受體功能引起類似精神分裂癥的癥狀，在嚙齒類動物中引起一系列復雜的行為學改變，常作為篩選抗精神分裂癥潛在藥物的經典動物模型[2]。本研究中應用MK-801腹腔給藥處理未成年大鼠，阻斷其腦內NMDA受體，從而破壞大鼠腦部NMDA系統(tǒng)的發(fā)育，致使動物成年后出現(xiàn)NMDA受體功能低下導致的相關癥狀，如認知障礙和空間記憶障礙[14]。本研究結果顯示，淫羊藿苷可上調海馬體中NMDA受體NR1亞體的表達水平，從分子層面證實淫羊藿苷可增強NMDA受體的功能。

抗精神病藥物可通過BDNF介導的通路調節(jié)NMDA受體的功能。TrkB受體是BDNF的主要功能受體，表達在細胞膜上，BDNF可通過自分泌，與TrkB受體結合并使其活化，而PKC，Raf-1，ERK是TrkB受體下游信號通路之一，其蛋白表達水平與TrkB受體表達相關。

圖6 淫羊藿苷對ERK1／2表達水平的調節(jié)作用

本研究結果顯示，淫羊藿苷可上調被MK-801抑制的TrkB受體的表達水平，可能是由于其上調了BDNF的表達，致使TrkB受體的表達水平上升；可改善被MK-801下調的BDNF的表達水平，其很有可能通過BDNF介導的通路調節(jié)NMDA受體功能；PKC，Raf-1，ERK的表達水平均受到抑制，但淫羊藿苷可顯著提升這些蛋白的表達水平。結果顯示，淫羊藿苷很有可能通過激活BDNF／TrkB介導PKC／Raf-1／ERK信號通路增進NMDA受體的功能，進而治療NMDA受體功能低下導致的精神分裂癥。

本研究中，采用抗精神病藥物利培酮作為陽性對照。結果顯示，淫羊藿苷的療效接近利培酮，且調節(jié)NMDA受體的分子機制與利培酮相似，提示其在精神分裂癥治療領域具有良好的應用前景。現(xiàn)有抗精神病藥物都具有毒副作用（如錐體外系反應），也未見患者長期使用淫羊藿苷有明顯的毒副作用；相反，淫羊藿苷和現(xiàn)有抗精神病藥物聯(lián)用可改善患者的生活質量[7]，故淫羊藿苷很有可能成為現(xiàn)有抗精神病藥物的優(yōu)良替代品，但仍需進一步探索淫羊藿苷對多種不同精神分裂癥的治療效果。但由于本研究屬中短期實驗，淫羊藿苷的毒副作用可能尚未表現(xiàn)出來，后續(xù)研究中應對比現(xiàn)有抗精神病藥物，系統(tǒng)研究長期使用淫羊藿苷可能引起的毒副作用；且淫羊藿苷是否還通過其他信號通路調節(jié)NMDA受體也有待進一步研究。