川芎定痛膠囊對偏頭痛大鼠模型行為學(xué)的影響及作用機(jī)制研究

劉紅淼 ，李艷玲 ，楊繼章 ，李梅芹 ，張林彥

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊 050031； 2.石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù) ＜石家莊＞有限公司，河北石家莊 050051； 3.石藥控股集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 050051）

偏頭痛是一種神經(jīng)內(nèi)科常見原發(fā)性頭痛，臨床主要癥狀為單側(cè)或雙側(cè)出現(xiàn)較重的搏動樣頭痛，且長期反復(fù)發(fā)作，發(fā)生部位以偏側(cè)頭部為主，常伴有惡心、嘔吐等自主癥狀。偏頭痛會嚴(yán)重影響到患者的生活和工作，降低生活質(zhì)量，還可導(dǎo)致腦梗死、腦白質(zhì)病變及產(chǎn)生認(rèn)知功能方面的障礙[1]。三叉神經(jīng)血管學(xué)說認(rèn)為，偏頭痛的病理機(jī)制與神經(jīng)源性炎性反應(yīng)相關(guān)，其中血管活性物質(zhì)內(nèi)皮素（ET）、一氧化氮（NO）、5- 羥色胺（5-HT）的含量異常變化，以及神經(jīng)遞質(zhì) β-內(nèi)啡肽（β-EP）、降鈣素（CGRP）的分泌異常對神經(jīng)源性炎性反應(yīng)的發(fā)生起到了重要作用[2]。目前，臨床尚無成熟的中藥成方制劑可治療偏頭痛。偏頭痛屬中醫(yī)“腦風(fēng)”“頭風(fēng)”范疇，為肝風(fēng)上擾、氣血逆亂、瘀血阻絡(luò)所致[3]。川芎定痛膠囊是由川芎、白芷、延胡索、絞股藍(lán)等藥組方，具有調(diào)和氣血、平肝熄風(fēng)、活絡(luò)安神止痛之功效，作為醫(yī)院特色制劑（批準(zhǔn)文號為冀藥制字Z05000005）在臨床應(yīng)用10余年，對偏頭痛有良好療效。為進(jìn)一步探討和驗證其藥理作用，本研究中考察了川芎定痛膠囊對偏頭痛大鼠模型的行為學(xué)影響及其作用機(jī)制，以進(jìn)一步完善對川芎定痛膠囊的研究?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：R320型低速冷凍離心機(jī)（北京白洋離心機(jī)有限責(zé)任公司）；YP30000型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司，精度為 0.01 g）；Varioskan Flash 酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司）。

試藥：川芎定痛膠囊（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院自制，批號為20190301）；正天丸（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號為1905102）；硝酸甘油注射液（北京益民藥業(yè)有限公司，批號為20190806）；氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，批號為19051906）；CGRP檢測試劑盒（批號為 201900512），ET檢測試劑盒（批號為 20190905），NO檢測試劑盒（批號為20190102），5-HT檢測試劑盒（批號為 20190511），β -EP 試劑盒（批號為 20190305），均購自南京建成生物工程研究所。

動物：SD 大鼠，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量（200 ±20）g，合格證號為NO.1100111911004367，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[實驗動物使用許可證號為SYXK（冀）2016-006]，于SPF屏障系統(tǒng)中自由飲水、標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，保持室內(nèi)溫度20～25℃、相對濕度40% ～70%、12 h／12 h明暗交替照明。

1.2 方法

動物分組與建模：60只SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組（A組）、模型組（B組）、陽性對照組（C組）和川芎定痛膠囊低、中、高劑量組（D1，D2，D3組），各 10 只，雌雄各半。C 組大鼠給予正天丸 3.0 g ／kg，D1，D2，D3組大鼠分別給予川芎定痛膠囊0.5，1.0，2.0 g ／kg，每天灌胃給藥 1 次；A 組和 B 組大鼠均給予等體積生理鹽水），連續(xù)給藥5 d。各組末次給藥30 min后，皮下注射硝酸甘油注射液10 mg／kg[3]，建立偏頭痛動物模型，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為，造模30 min后大鼠出現(xiàn)撓頭、耳紅及爬籠等煩躁表現(xiàn)。

行為學(xué)觀察：于大鼠注射硝酸甘油 5 min后，記錄 2 h內(nèi)每30 min大鼠的前肢撓頭次數(shù)[4]。

血管活性物質(zhì)及神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測：大鼠造模4h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL／kg）進(jìn)行麻醉。腹主動脈取適量血，置無抗凝劑的真空采血管中，以3 000 r／min離心15 min，分離血漿，液氮中冷凍保存，備用。按相關(guān)試劑盒說明進(jìn)行操作，分別測定血清中CGRP，ET，NO的含量。采血后，斷頭處死，立即在冰上剖取腦組織，剝離后于液氮中冷凍保存。稱取腦組織0.5 g，加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液1.5 mL，在冰浴下充分勻漿，以3 000 r／min離心25 min，分離血漿，冷凍保存?zhèn)溆?。按相關(guān)試劑盒說明書標(biāo)明的方法進(jìn)行操作，分別測定腦組織中5-HT和β-EP的含量[5-6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察

與A組比較，B組大鼠在各時間段撓頭次數(shù)均顯著增加（P ＜0.01）。與 B 組比較，C組（30～120 min）和 D3組（30～120 min）、D2組（60～90 min）的撓頭次數(shù)均顯著減少（P ＜0.05，P ＜0.01）。詳見表 1。

2.2 大鼠檢測指標(biāo)

與A組比較，B組血清中CGRP，ET，NO含量均顯著升高（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01），腦組織中的 5-HT 和β-EP水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與 B 組比較，C組和 D3，D2組大鼠血清中 CGRP，ET，NO 含量均顯著降低（P ＜0.05，P ＜0.01），腦組織中 5-HT 和β-EP水平均顯著升高（P ＜0.05，P＜0.01）。詳見表 2。

表1 各組大鼠撓頭次數(shù)比較（±s，次，n＝10）

表1 各組大鼠撓頭次數(shù)比較（±s，次，n＝10）

注：與 A 組比較， P＜0.01；與 B 組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。下表同。

組別A組B組C組D1組D2組D3組0～30 min 5.30 ± 1.82 49.15 ±10.23 48.52 ±6.93 47.03 ± 8.93 48.34 ±8.01 46.03 ±5.75 30～60 min 6.20 ± 2.35 39.86 ±5.75 30.31 ±9.47＃＃39.22 ± 11.93 36.06 ±9.78 30.43 ±8.39＃＃60～90 min 5.30 ± 1.66 29.03 ±6.77 20.59 ±4.53＃＃22.99 ± 9.14 21.76 ±4.92＃＃19.80 ±6.73＃＃90～120 min 4.50 ± 2.01 14.87 ± 5.28 9.27 ± 2.50＃13.23 ± 3.20 10.55 ± 2.42 9.06 ± 2.10＃

表2 各組大鼠血清中 CGRP，ET，NO和腦組織中5-HT和-EP水平比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清中 CGRP，ET，NO和腦組織中5-HT和-EP水平比較（±s，n＝10）

組別A組B組C組D 1組D 2組D 3組C G R P（n g／L）3 9.2 5 ±1 0.0 5 8 1.3 8 ±1 4.1 0 6 7.2 2 ±1 1.8 1＃7 2.0 3 ±1 2.1 9 6 5.4 3 ±1 4.9 9＃6 0.6 1 ±1 0.5 6＃E T（n g／L）7 5.6 5 ±6.1 1 8 5.5 0 ±1 0.0 2 7 4.3 ±7.4 2＃8 0.2 2 ±8.1 5 7 4.9 8±5.3 5＃7 4.3 1±6.5 5＃N O（ m o l／L）4 2.1 5 ±8.2 4 7 3.8 4 ±1 2.0 4 4 9.9 8 ±1 0.0 9＃＃5 5.7 5±9.0 3＃5 3.0 3±6.0 2＃4 5.6 2 ±8.4 4＃＃5-H T （n g／m L）3.0 1 ±0.3 9 1.2 2 ±0.3 5 2.7 7 ±1.5 9＃＃1.5 9 ±0.9 2 1.8 5 ±0.8 9＃2.0 2 ±0.7 6＃-E P（p g／g）3 5 5.1 0 ±2 5.7 7 3 0 0.1 5 ±2 2.0 3 3 6 1.3 5±2 5.0 7＃3 4 5.6 5±2 1.3 7＃3 5 7.5 6±3 0.0 5＃3 6 0.7 2±2 8.4 7＃

3 討論

神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)在偏頭痛發(fā)病過程中有重要作用，這一過程主要涉及 CGRP，ET，NO，5-HT，β-EP等活性物質(zhì)。目前，CGRP被認(rèn)為是體內(nèi)作用最強(qiáng)的擴(kuò)血管活性物質(zhì)，可通過調(diào)控不同血管床的通透性，在調(diào)節(jié)組胺誘導(dǎo)的血管擴(kuò)張反應(yīng)、神經(jīng)性炎癥及疼痛中起著重要作用[6]。偏頭痛發(fā)作過程中，CGRP大量釋放，其作用于血管壁產(chǎn)生一系列反應(yīng)，導(dǎo)致血漿蛋白外滲、神經(jīng)源性炎癥，使得肥大細(xì)胞脫顆粒、血小板活化及腦膜血管擴(kuò)張，最終傳至丘腦和皮質(zhì)，產(chǎn)生疼痛[7-8]。ET可通過收縮血管起到調(diào)節(jié)腦血管緊張度的作用，使腦部微血管的通透性增加，促進(jìn)蛋白外滲，從而引起炎性反應(yīng)[9]。NO是偏頭痛發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的物質(zhì)，其擴(kuò)張血管作用可引發(fā)神經(jīng)源性炎癥，導(dǎo)致受損的感覺神經(jīng)元的敏感性增加，通過介導(dǎo)身體疼痛信號的傳遞，放大生物學(xué)作用，導(dǎo)致疼痛發(fā)生[10-11]。5-HT水平在偏頭痛發(fā)作前就開始增加，可直接收縮血管引起先兆期血管痙攣收縮，其通過快速代謝使得發(fā)作期血液中5-HT濃度降低，引發(fā)偏頭痛血管擴(kuò)張性疼痛[12-13]。β-EP是一種α-內(nèi)源性阿片肽，具有強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用，其通過抑制P物質(zhì)的釋放，使三叉神經(jīng)管和脊髓的神經(jīng)感覺的疼痛抑制。

本研究結(jié)果表明，造模后大鼠血清中的CGRP，ET，NO和腦內(nèi)5-HT，β-EP等活性物質(zhì)含量都產(chǎn)生了較明顯變化，川芎定痛膠囊可降低CGRP，ET，NO含量，增加5-HT和β-EP水平，使其接近正常生理水平。這種多靶點的綜合效應(yīng)可達(dá)到抑制偏頭痛發(fā)病過程中的一系列疼痛反應(yīng)，產(chǎn)生較強(qiáng)的緩解偏頭痛的作用，表明川芎定痛膠囊可通過調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)水平、促進(jìn)腦神經(jīng)遞質(zhì)釋放，達(dá)到調(diào)節(jié)血管收縮與舒張作用，抑制不良信息的傳導(dǎo)，發(fā)揮治療偏頭痛的作用。

綜上所述，川芎定痛膠囊對偏頭痛大鼠模型的行為學(xué)具有改善作用，其作用機(jī)制與降低血清中CGRP，ET，NO含量及升高腦組織中5-HT和β-EP水平有關(guān)。