具有遺傳相關(guān)性的玉米品種內(nèi)生細(xì)菌的分離與多樣性研究

楊福珍， 武纖雨， 張如養(yǎng)， 李 苗， 徐田軍， 劉 洋,， 趙久然,

(1.北京科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院， 北京 100083； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 玉米研究中心， 北京 100097)

玉米又稱苞谷、苞米，是世界上廣泛栽培的農(nóng)作物，也是我國(guó)重要的糧食作物，種植面積為全國(guó)糧食作物種植面積的三分之一[1]。玉米產(chǎn)量高、用途廣，在糧食、飼料、工業(yè)、醫(yī)藥原料等方面均具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。提高玉米生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量，對(duì)改善人民生活、發(fā)展國(guó)家經(jīng)濟(jì)及提升國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有十分重要的意義[2]。影響玉米產(chǎn)量的原因有很多，新品種的培育占35%[3]。中國(guó)各玉米產(chǎn)區(qū)地質(zhì)不同，雜交玉米具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病等特性，能夠保障我國(guó)糧食生產(chǎn)安全及農(nóng)業(yè)增收[4]。

內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中必不可少的組成部分，生活于植物組織內(nèi)，與宿主形成了緊密的共生關(guān)系。有益內(nèi)生細(xì)菌在植物生物防治、耐受抗病及促進(jìn)生長(zhǎng)中起到重要作用[5-6]。已有研究證實(shí)，內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于植物的多種器官中，包括根、莖、葉、種子、花和果實(shí)等[7]。植物內(nèi)生細(xì)菌種類多，其中優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬等[8-11]。同時(shí)，隨著研究方法持續(xù)更新，內(nèi)生細(xì)菌新種的發(fā)現(xiàn)不斷豐富著細(xì)菌資源[12-14]。

植物內(nèi)生細(xì)菌可以寄生于不同的宿主植物，隨著植物微生態(tài)研究的不斷發(fā)展與深入，目前，已有上百種植物的微生態(tài)被研究[15]，包括水稻、小麥、棉花、高粱、甜菜、玉米等[16-18]。有益內(nèi)生細(xì)菌在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色。近年來(lái)，有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌的研究報(bào)道逐漸增多[19]，玉米內(nèi)生細(xì)菌的研究也越來(lái)越受重視。在實(shí)驗(yàn)材料方面，有關(guān)玉米內(nèi)生細(xì)菌的研究多集中于根、莖、葉[20-21]，玉米種子內(nèi)生細(xì)菌則很少有研究[22]。影響內(nèi)生細(xì)菌多樣性的原因有很多，相對(duì)于同種玉米不同發(fā)育時(shí)期的研究[23]，不同種類玉米的研究則很少。本實(shí)驗(yàn)選用具有遺傳相關(guān)性的玉米種子為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究玉米種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性，以此來(lái)獲取豐富的玉米種子內(nèi)生細(xì)菌資源；同時(shí)解析不同宿主內(nèi)生細(xì)菌之間的聯(lián)系與差異，并且探尋內(nèi)生細(xì)菌在雜交玉米世代之間的縱向傳遞規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1玉米種子的采集

實(shí)驗(yàn)樣品為玉米雜交品種(京科665、京科968、MC738、京農(nóng)科728)及其親本(京725、京92、京724、京2416、MC01)，種子樣品由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心自主培育。供試玉米材料品種遺傳關(guān)系見(jiàn)圖1。樣品于2019年采自于海南省三亞市南濱農(nóng)場(chǎng)北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心南繁基地(北緯18.35774333340131度，東經(jīng)109.18169975280762度，中國(guó)南方)，4 ℃保存。

圖1 9種玉米樣品間遺傳相關(guān)性Fig.1 Genetic relationships among nine maize samples

1.1.2培養(yǎng)基及試劑

LB、TSA、R2A成品培養(yǎng)基，北京陸橋公司; PCR相關(guān)試劑，TIANGEN公司，PCR引物由北京諾賽生物公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品表面滅菌

先將玉米種子用無(wú)菌水清洗4～5次，之后首先用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液浸泡3 min，再用氯離子質(zhì)量濃度為250 mg/L的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡30 s，最后用無(wú)菌水淋洗5～7次，在無(wú)菌濾紙無(wú)菌條件下晾干[24]；同時(shí)取最后一次淋洗水120 μL涂于LB固體平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，檢測(cè)玉米種子表面滅菌效果[25]。表面滅菌徹底的種子用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

玉米內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)。取適量表面滅菌的玉米種子用無(wú)菌研缽研磨成粉末,在超凈工作臺(tái)取2 g的玉米種子粉末樣品于50 mL離心管，加20 mL無(wú)菌水。采用梯度稀釋法制備稀釋倍數(shù)為1×10-1到1×10-4的系列稀釋液。分別取稀釋梯度為10-3和10-4的玉米種子稀釋樣品100 μL 涂布于 LB、TSA、R2A平板上，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行，30 ℃培養(yǎng)3 d后根據(jù)平板上菌落的形態(tài)(表面光澤度、透明度、大小、顏色、形狀、邊緣整齊度等)隨機(jī)挑取具有代表性的單菌落[26]，純化后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列分析

采用破碎法粗提取細(xì)菌基因組DNA。用正向引物799F (5′-AACAGGATTAGATACCCTG-3′)和反向引物1492R (5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT- 3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA。PCR反應(yīng)體系(50 μL): DNA 模板1 μL、PCR Mix 25 μL、引物799F (10 mmol/L) 2 μL、引物 1492R (10 mmol/L) 2 μL， ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性40 s，55 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃ 延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用DYY- 8C型DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的結(jié)果在EZ biocloud中進(jìn)行比對(duì)，確定與已知序列同源關(guān)系，當(dāng)序列相似性達(dá)到98.65%以上時(shí)歸為同一個(gè)運(yùn)算的操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從玉米雜交品種(京科665、京科968、MC738、京農(nóng)科728)及其親本(京725、京92、京724、京2416、MC01)中分別挑取2、7、8、12、7、6、12、13、17株細(xì)菌，分別有2、4、5、7、2、1、3、3、4個(gè)代表菌株(表1～表9)，將代表菌株序列信息提交到 GenBank，并獲得登錄號(hào)。

表1 玉米京科665種子內(nèi)生細(xì)菌分布

表2 玉米京科968種子內(nèi)生細(xì)菌分布

表3 玉米MC738種子內(nèi)生細(xì)菌分布

表4 玉米京農(nóng)科728種子內(nèi)生細(xì)菌分布

表5 玉米京725種子內(nèi)生細(xì)菌分布

表6 玉米京92種子內(nèi)生細(xì)菌分布

表7 玉米京724種子內(nèi)生細(xì)菌分布

表8 玉米京2416種子內(nèi)生細(xì)菌分布

表9 玉米MC01種子內(nèi)生細(xì)菌分布

由玉米京725×京92雜交而得的玉米京科665種子內(nèi)生細(xì)菌分布，見(jiàn)表1和圖2。在京科665中，內(nèi)生細(xì)菌并不豐富，僅有2個(gè)OTUs，均屬于Bacillus(100%)，Bacillusaltitudinis41KF2bT和Bacillussubtilissubsp.subtilisNCIB 3610T是并列第一優(yōu)勢(shì)種。在母本京725和父本京92中，見(jiàn)表5、表6和圖2，與其雜交后代相似，也分別僅有2和1個(gè)OTUs，均屬于Bacillus(100%)。其中Bacillussubtilissubsp.subtilisNCIB 3610T為親本與子代共有菌種，且為父本京92的第一優(yōu)勢(shì)種，母本京725的第二優(yōu)勢(shì)種。

圖2 9種玉米種子樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬及其豐度分析Fig.2 Analysis of dominant genera from samples of nine maize seeds

由玉米京724×京92雜交而得的玉米京科968種子內(nèi)生細(xì)菌分布，見(jiàn)表2和圖2。在京科968中，包含有4個(gè)OTUs，分別屬于Bacillus(71.42%)、Micrococcus(14.28%)和Kocuria(14.28%)。其中BacillusmarisflaviJCM 11544T為第一優(yōu)勢(shì)種，BacillusfrigoritoleransDSM 8801T、MicrococcusyunnanensisYIM 65004T和KocuriaroseaDSM 20447T并列為第二優(yōu)勢(shì)種。在母本京724中，見(jiàn)表7和圖2，包含有3個(gè)OTUs，分別屬于Bacillus(75%)和Staphylococcus(25%)。第一優(yōu)勢(shì)種為Bacillusaltitudinis41KF2bT，第二優(yōu)勢(shì)種為Staphylococcusequorumsubsp.equorumATCC 43958T，第三優(yōu)勢(shì)種為BacillusparamycoidesNH24A2T。京科968內(nèi)生細(xì)菌中雖未包含有與親本中相同的菌種，但與其父本母本的第一優(yōu)勢(shì)菌屬都是Bacillus。

由玉米京724×京2416雜交而得的玉米MC738種子內(nèi)生細(xì)菌分布，見(jiàn)表3和圖2。在MC738中，內(nèi)生細(xì)菌較親本更豐富一些，包含有5個(gè)OTUs，分別屬于Bacillus(50%)、Micrococcus(25%)、Oceanobacillus(12.5%)和Psychrobacter(12.5%)。BacillusmegateriumNBRC 15308T、BacillusindicusLMG 22858T和MicrococcusaloeveraeAE- 6T并列為第一優(yōu)勢(shì)種，OceanobacilluspicturaeLMG 19492T和PsychrobacterlutiNF11T并列為第二優(yōu)勢(shì)種。在父本京2416中，見(jiàn)表8和圖2，包含有3個(gè)OTUs，分別屬于Bacillus(61.54%)和Kocuria(38.46%)。KocuriaroseaDSM 20447T(X87756)為第一優(yōu)勢(shì)種，BacillusmegateriumNBRC 15308T和Bacillussubtilissubsp.subtilisNCIB 3610T為第二優(yōu)勢(shì)種。MC738與其父本京2416存在相同的優(yōu)勢(shì)菌種，即MC738的第一優(yōu)勢(shì)種BacillusmegateriumNBRC 15308T也是京2416的第二優(yōu)勢(shì)種。

由玉米MC01×京2416雜交而得的玉米京農(nóng)科728種子內(nèi)生細(xì)菌分布，見(jiàn)表4和圖2。在京農(nóng)科728中，包含有7個(gè)OTUs，分別屬于Bacillus(50%)、Micrococcus(41.67%)和Pantoea(8.33%)。MicrococcusyunnanensisYIM 65004T是第一優(yōu)勢(shì)種，BacillussongklensisCAU 1033T是第二優(yōu)勢(shì)種，Bacillussubtilissubsp.subtilisNCIB 3610T、BacillusfengqiuensisNPK15T(KC291653)、BacillusfrigoritoleransDSM 8801T、BacillustequilensisKCTC 13622T和PantoeadispersaLMG 2603T并列為第三優(yōu)勢(shì)種。在母本MC01中，見(jiàn)表9和圖2，包含有4個(gè)OTUs，分別屬于Pantoea(58.82%)、Bacillus(23.53%)和Raoultella(17.65%)。其中Pantoeastewartiisubsp.stewartiiLMG 2715T(Z96080)為第一優(yōu)勢(shì)種，Pantoeastewartiisubsp.indologenesLMG 2632T和BacillusaquimarisTF- 12T并列為第二優(yōu)勢(shì)種，RaoultellaplanticolaATCC 33531T為第三優(yōu)勢(shì)菌。京農(nóng)科728與其父本京2416存在相同的優(yōu)勢(shì)菌種，即京農(nóng)科728的第三優(yōu)勢(shì)種Bacillussubtilissubsp.subtilisNCIB 3610T也是京2416的第二優(yōu)勢(shì)種。

雜交玉米京科665和京科968有共同的父本(京92)，但母本不同。京科968內(nèi)生細(xì)菌群落比京科665豐富，見(jiàn)圖2，Bacillus均是二者的第一優(yōu)勢(shì)菌屬，同時(shí)也是共同父本京92的第一優(yōu)勢(shì)菌屬。雜交玉米京科968和MC738有共同母本(京724)，但父本不同。MC738內(nèi)生細(xì)菌群落相對(duì)京科968更為豐富，見(jiàn)圖2，Bacillus和Micrococcus是二者所共有的優(yōu)勢(shì)菌屬，并且Bacillus也是共同母本京724的第一優(yōu)勢(shì)菌屬。雜交玉米MC738和京農(nóng)科728有共同父本(京2416)，但母本不同。MC738與京農(nóng)科728內(nèi)生細(xì)菌群落都比較豐富，見(jiàn)圖2，Bacillus和Micrococcus同時(shí)是二者的第一優(yōu)勢(shì)菌屬和第二優(yōu)勢(shì)菌屬，并且Bacillus也是共同父本京2416的第一優(yōu)勢(shì)菌屬。雖然各品種雜交玉米的內(nèi)生細(xì)菌群落在數(shù)量和種類上有所差異，但是優(yōu)勢(shì)菌屬均存在于其親本中，并且均為Bacillus。

3 分析與討論

種子是種子植物的繁殖體系，對(duì)延續(xù)物種起著重要作用。中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，種子作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基本、最重要的生產(chǎn)資料，市場(chǎng)對(duì)于單產(chǎn)高、抗性好的種子需求越來(lái)越明顯[27]。種子微生物是指生活于種子內(nèi)或者是種子際的各種微生物的統(tǒng)稱。隨著與植物相關(guān)的微生物越來(lái)越受到重視，但相對(duì)根、莖等器官，與種子相聯(lián)合微生物雖具有普遍性和多樣性，但研究則較少[28]。集中于玉米種子微生物，特別是內(nèi)生細(xì)菌的研究，相對(duì)于水稻、大麥則更少[29]。本研究以具有遺傳相關(guān)性的玉米種子為研究對(duì)象，以傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法對(duì)玉米種子內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行研究，旨在探索玉米種子親子代之間內(nèi)生細(xì)菌群落的相關(guān)性。

研究結(jié)果表明，玉米內(nèi)生菌在親子代之間在遺傳上具有一定的相關(guān)性，同時(shí)具有相同親本的雜交玉米之間也有一定的相關(guān)性。親本與其子代在內(nèi)生菌代表菌株數(shù)目上相近，且存在相同的優(yōu)勢(shì)菌種。如子代京科665、親本京725和京92分別有2、2、1個(gè)OTUs，Bacillussubtilissubsp.subtilisNCIB 3610T是三者的共同優(yōu)勢(shì)菌種。子代MC738、親本京724和京2416分別有5、3、3個(gè)OTUs，BacillusmegateriumNBRC 15308T是MC738與其父本京2416的共同優(yōu)勢(shì)菌種。來(lái)自共同親本的子代之間存在共同優(yōu)勢(shì)菌屬。如具有共同父本京92的雜交玉米京科665和京科968，Bacillus是二者的共同優(yōu)勢(shì)菌屬。具有共同母本京724的雜交玉米京科968和MC738，Bacillus和Micrococcus是二者的共同優(yōu)勢(shì)菌屬。具有共同父本京2416的雜交玉米MC738和京農(nóng)科728，Bacillus和Micrococcus是二者的共同優(yōu)勢(shì)菌屬。因此，具有遺傳相關(guān)性的玉米種子親子代之間、不同子代之間的內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性存在有優(yōu)勢(shì)菌種或優(yōu)勢(shì)菌屬的相似性。多種因素會(huì)對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性造成影響。Yang等[30]在研究牡丹內(nèi)生細(xì)菌在不同組織和不同品種中的多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Pseudomonas和Enterobacteriaceae在根樣品中普遍存在，而葉樣品中的優(yōu)勢(shì)屬為Succinivibrio和Acinetobacter。而且不同牡丹品種之間內(nèi)生細(xì)菌豐度不同。在生姜中也含有多種內(nèi)生細(xì)菌，隨著宿主的生長(zhǎng)，內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和類型在不斷減少，即在生姜幼苗期時(shí)，內(nèi)生細(xì)菌種類最多，密度最大，根莖增大期時(shí)種類最少，密度最小[31]。

種子作為植物重要的繁殖器官，是多種有益細(xì)菌和病原菌的載體[32]。很多原因?qū)ΨN子內(nèi)生細(xì)菌多樣性產(chǎn)生一定的影響。在水稻種子中，同一水稻品種成熟期相比于灌漿期菌群種類較豐富,種子內(nèi)生細(xì)菌的組成與其發(fā)育時(shí)期有一定的關(guān)系[33]。Mundt等[34]通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)多種植物種子的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng), 實(shí)驗(yàn)表明在相同的培養(yǎng)條件下, 從甜椒、蘿卜、黑麥、苜?？煞蛛x到46種細(xì)菌，但含羞草、黃桑種子則很難分離到細(xì)菌?？赡苁且?yàn)椴煌N子的外在形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)對(duì)種子內(nèi)生細(xì)菌群落造成影響。劉媛等[35]在探究棕櫚科植物種子內(nèi)生細(xì)菌群落及其物種差異時(shí)發(fā)現(xiàn)不同的物種各級(jí)內(nèi)生細(xì)菌分類階層總數(shù)不同，群落組成隨物種不同而異。

本研究中的玉米種子主要內(nèi)生菌屬(Bacillus、Micrococcus、Kocuria、Oceanobacillus、Psychrobacter、Pantoea、Staphylococcus和Raoultella)，也廣泛分布于玉米的根、莖、葉等器官部位中，有一些屬于植物有益細(xì)菌，具有多種生物學(xué)作用。Bacillus能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)HCN，能有效抑制玉米大斑病菌、水稻紋枯病菌等多種病原菌菌絲的生長(zhǎng)，具有明顯的抑菌抗病性[36]。Micrococcusluteus能夠表達(dá)海藻糖磷酸酶和磷脂酶D從而增加植物的耐鹽性和耐旱性[37]。紅樹(shù)根中的Psychrobacter能夠分解纖維素和脂肪，也具有抗真菌病原體的活性，是潛在的醫(yī)藥抗生素來(lái)源[38]。利用微生物來(lái)減少土壤中的重金屬污染可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)。分離自植物根部的Kocuriasp.CRB15可以定殖于植物幼苗，使得幼苗在Cu2+處理后也能正常生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物耐受重金屬的能力。同時(shí)也具有高效的溶磷能力，產(chǎn)IAA的能力，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)[39]。Raoultellasp.通過(guò)離子交換攝取土壤中的Cd2+，修復(fù)重金屬污染的土壤，形成有利于植株生長(zhǎng)的環(huán)境。同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生吲哚乙酸、溶解磷酸鹽，使植株能夠攝取更充足的營(yíng)養(yǎng)[40]。植物有益細(xì)菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)重要組成，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中抑制有害病菌、增強(qiáng)耐受性等方面均發(fā)揮著重要的作用。

4 結(jié) 論

研究玉米種子內(nèi)生細(xì)菌與其宿主相關(guān)性，對(duì)玉米育種及農(nóng)業(yè)發(fā)展有重要參考意義。本研究用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法研究雜交玉米種子及其親本的內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性，結(jié)果表明具有遺傳相關(guān)性的玉米親子代、不同子代之間的內(nèi)生細(xì)菌群落存在有優(yōu)勢(shì)菌種或優(yōu)勢(shì)菌屬的相似性。親本與其子代在內(nèi)生菌代表菌株數(shù)目上相近，且存在相同的優(yōu)勢(shì)菌種。來(lái)自共同親本的子代之間存在共同優(yōu)勢(shì)菌屬。但目前的研究還局限于內(nèi)生細(xì)菌的群落多樣性，后續(xù)研究可以進(jìn)一步探尋內(nèi)生細(xì)菌在玉米中橫向及縱向的傳遞規(guī)律。