HLA與HPA配型不合導(dǎo)致血小板輸注無效1例

王皓 郭興瑩 張志波 張新萍 冀春紅 黃象艷

血小板輸注無效（platele ttrans fusion refractoriness, PTR）是指患者在至少連續(xù)兩次輸注ABO血型相合且其中至少一次保存時(shí)間在48 h以內(nèi)的血小板后，血小板計(jì)數(shù)未見有效提升，臨床出血癥狀未得到明顯改善[1]。大約30%～70%患者多次輸注血小板制品后會產(chǎn)生血小板抗體，導(dǎo)致同種免疫反應(yīng)而發(fā)生PTR[2]。引起同種免疫反應(yīng)的血小板抗原分為兩類：一類是血小板相關(guān)性抗原，包括HLA-Ⅰ類抗原、ABH、Lewis、P抗原等；另一類為血小板特異性抗原（HPA）。HLA抗體是引起免疫性PTR的主要原因，其次是HPA抗體，兩種抗體可同時(shí)存在[3]。HLA基因和HPA基因頻率在不同種族、地域的人群中存在差異[4，5]。本文對1例血小板配型困難的嚴(yán)重PTR患者進(jìn)行研究。

資料與方法

1 一般資料

1.1 臨床資料： 患者，女性，28歲，已婚，育一子，血型為O型，Rh(D)陽性，不規(guī)則抗體篩查陰性。臨床診斷：重型再生障礙性貧血?；颊哂?016年10月9日開始出現(xiàn)面黃、乏力并牙齦出血不止、雙下肢皮膚瘀斑，血常規(guī)顯示三系降低，于10月12日入住我院，并于12日與14日各輸注1個(gè)治療量O+機(jī)采血小板，血小板計(jì)數(shù)得到有效提升。但當(dāng)17日、20日再次輸注各1個(gè)治療量血小板后，患者血小板計(jì)數(shù)不升反降。該患者無發(fā)熱、肝脾腫大、DIC、骨髓移植等，未使用抗生素。10月21日～10月27日，為該患者篩選相容性血小板，未成功。此期間患者血小板計(jì)數(shù)繼續(xù)降低，出現(xiàn)痰中帶血、陰道出血不止等情況，繼續(xù)為患者輸注隨機(jī)血小板4個(gè)治療量，于10月27日患者血小板計(jì)數(shù)降至1×109/L。該患者最終因重型再障并發(fā)急性腦出血死亡。

1.2 血小板輸注療效觀察：用血小板計(jì)數(shù)增加校正指數(shù)（corrected count increment，CCI）作為判斷血小板輸注是否有效的指標(biāo)：CCI=（輸注后Plt-輸注前Plt）(/L)×體表面積（m2）/輸入血小板數(shù)（×1011）；體表面積=0.006 1×患者身高（cm）＋0.012 8×患者體重（kg）-0.015 29。若輸注ABO相合血小板后24 h CCI＜4.5，判斷為血小板輸注無效，反之為輸注有效[6]。

1.3 主要試劑和儀器：DNA提取試劑盒（TIANamp BloodDNA Kit, Tiangen Biotech CO., LTD, Beijing,China）、MASPAT試劑盒（Sanquin，Netherlands）、LCT細(xì)胞板（One Lambda，America）、GTI-PAKPLUS試劑盒(BoFuRui Gene Diagnostics,Beijing, China)、HLA分型試劑盒（Fluogene，Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg,Germany）、HPA分型試劑盒（Fluogene，Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg, Germany）。

2 方法

2.1 血小板交叉配型與血小板自身抗體檢測：采用固相凝集法進(jìn)行血小板交叉配型，按照MASPAT試劑盒說明書進(jìn)行操作。微孔內(nèi)加入供者血小板，在微孔表面形成單細(xì)胞層，加入患者血清與LISS（低離子強(qiáng)度溶液）進(jìn)行孵育，使患者血清中的抗體與固定的血小板單細(xì)胞層結(jié)合，洗去未結(jié)合的血清成分。加入鼠單克隆抗人IgG和人IgG致敏紅細(xì)胞后離心，若微孔底部形成一層紅細(xì)胞，表明結(jié)果為陽性，血小板交叉配型不合；若紅細(xì)胞在微孔板底部形成紐扣狀，表明結(jié)果為陰性，血小板交叉配型相合。

將上述步驟中供者血小板懸液換為患者自身血小板懸液，其余步驟相同，若微孔底部形成一層紅細(xì)胞為陽性結(jié)果，表明存在血小板自身抗體；若微孔底部形成紐扣狀，則不存在血小板自身抗體。

2.2 血清學(xué)試驗(yàn)

2.2.1 群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibodies，PRA）檢測：使用美國One Lambda 公司的細(xì)胞板(lambda cell tray，LCT)來檢測患者PRA值，按照補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒方法，將表達(dá)不同HLA-I類抗原的淋巴細(xì)胞包被Terasaki板并冷凍處理，加入患者血清與補(bǔ)體，根據(jù)補(bǔ)體介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)原理, 染色后在顯微鏡下計(jì)數(shù)死亡淋巴細(xì)胞的比例以判斷抗體水平。

2.2.2 血小板抗體篩查：使用GTI-PAKPLUS血小板抗體檢測試劑盒，按照廠家說明書進(jìn)行操作，檢測患者血清中HPA-1a/1a, 3a/3a, 4a、HPA-1b/1b, 3b/3b, 4a、HPA-5b/5b、HPA-5a/5a、GP-Ⅰb/Ⅸ、GP-Ⅳ、HLA等抗體是否存在。

2.3 基因?qū)W檢測

2.3.1 血液DNA提?。翰杉颊哽o脈血液2 mL于EDTA抗凝管中，使用血液DNA提取試劑盒提取患者血液DNA，嚴(yán)格按照廠家說明書進(jìn)行操作。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測，DNA濃度為76 ng/μL, OD260/OD280值為1.83。

2.3.2 HLA與HPA基因分型檢測：將提取的患者DNA樣品用FluoGene法進(jìn)行HLA與HPA基因分型，分別使用HLA分型試劑盒與HPA分型試劑盒，嚴(yán)格按照廠家說明書進(jìn)行操作。

結(jié) 果

1 血小板輸注療效觀察：見表1。

2 血清學(xué)檢測結(jié)果

2.1 群體反應(yīng)性抗體（PRA）：100%。

2.2 血小板自身抗體：弱陽性。

2.3 血小板抗體篩查：見表2。

3 基因?qū)W檢測結(jié)果

3.1 患者HLA基因分型：HLA-A*30，*33; HLA-B*50，*58。

3.2 患者HPA基因分型：HPA-1aa、2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、9aa、15ab。

表1 血小板輸注療效

表2 血小板抗體篩查結(jié)果

討 論

本病例患者住院初期兩次輸注血小板可有效提升血小板計(jì)數(shù)，但后續(xù)連續(xù)兩次輸注足量ABO同型血小板后，24 h血小板計(jì)數(shù)不升反降，根據(jù)CCI計(jì)算數(shù)值可確診為PTR。非免疫性與免疫性因素均可導(dǎo)致PTR的發(fā)生，非免疫性因素主要有感染、發(fā)熱、脾腫大、DIC、骨髓移植等，這些因素可導(dǎo)致輸入的血小板質(zhì)量和活性降低、生存期變短、過度消耗等。免疫性因素包括同種免疫抗體、自身抗體以及藥物抗體等[7，8]。該患者治療過程中未出現(xiàn)發(fā)熱、肝脾腫大、DIC、骨髓移植等情況，未使用抗生素。出現(xiàn)PTR后，為患者輸注保存期在48 h內(nèi)的ABO同型血小板，血小板計(jì)數(shù)仍未能有效提升?；究膳懦龑?dǎo)致PTR的非免疫因素存在，初步考慮該患者發(fā)生PTR可能是由于免疫因素引起。

引起PTR的免疫因素以同種免疫抗體為主，其中大部分（約80%～90%）是由HLA-Ⅰ類分子引起的，僅約10%～20%是由HPA引起的[3,9]。若懷疑為HLA抗體導(dǎo)致的輸注無效，應(yīng)首先檢測群體反應(yīng)性抗體PRA。PRA＜20%時(shí)，考慮為非免疫因素導(dǎo)致的輸注無效；PRA＞20%時(shí)，表明有HLA同種免疫存在，應(yīng)隨后進(jìn)行HLA抗體檢測與HLA基因分型[10]。本病例患者PRA值為100%，HLA抗體檢測陽性，HLA基因分型為HLA-A*30，*33;HLA-B*50，*58。HLA基因頻率在不同種族、地域的人群中存在差異[4，5]。在北方漢族人群中，HLA-A*02、A*11、A*24、A*33、A*30、B*13、B*15、B*51、B*46、B*40、B*58有較高的頻率分布，而B*50的基因頻率僅為0.78%[4,11]，并不常見。當(dāng)患者輸注不相合血小板后體內(nèi)會產(chǎn)生血小板抗體，導(dǎo)致輸注無效。

HPA抗體常與HLA抗體共存，本病例患者血小板抗體篩查顯示體內(nèi)除HLA抗體外，還存在HPA抗體。中國漢族人群HPA-1、2、4、5、6均以a/a純合子為主，HPA-3和HPA-15是雜合度較高的兩個(gè)系統(tǒng)，表型分為a/a、a/b以及b/b三種，山東地區(qū)血小板捐獻(xiàn)人群中HPA-3a/3b和HPA-15a/15b的比例較高[12-14]。該患者HPA基因型為3aa純合子，也可導(dǎo)致輸注無效的發(fā)生。

當(dāng)患者體內(nèi)存在血小板自身抗體時(shí)，不僅自身血小板遭到破壞，輸入的異體血小板也會被破壞。該患者血小板抗體篩查結(jié)果均為強(qiáng)陽性，高度懷疑患者產(chǎn)生同種抗體同時(shí)合并自身抗體。自身抗體檢測的弱陽性結(jié)果可能與標(biāo)本中血小板數(shù)量較低有關(guān)。

對于同種免疫因素引起的PTR，可通過輸注相合血小板來解決。目前，篩選相合血小板的方法主要有三種：①鑒定受血者HLA基因型，選擇與受血者HLA基因型相合的血小板；②鑒定受血者HLA抗體的特異性，選擇不表達(dá)對應(yīng)抗原的血小板；③血小板交叉配型試驗(yàn)。前兩種方法對供體池和試驗(yàn)時(shí)間要求較高，本病例患者HLA基因型與HPA基因型并不常見，無法在短時(shí)間內(nèi)為患者找到合適的供者血小板。而血小板交叉配型操作簡單、結(jié)果易于判讀、無需較大儀器設(shè)備投入，并且能夠同時(shí)檢測HLA抗體與HPA抗體，廣泛用于免疫性PTR患者血小板篩選[15，16]。遺憾的是，三種方法均未能為患者找到相合血小板輸注。

目前，臨床上多數(shù)還是采用隨機(jī)性ABO同型血小板輸注，在發(fā)生輸注無效后會篩選相容性血小板。本病例患者在發(fā)生PTR后難以找到配型相合的血小板，這對我們的日常工作起到了警示作用，對于這種嚴(yán)重PTR患者該如何預(yù)防與治療值得思考。在發(fā)生PTR前采用相容性血小板輸注可明顯降低PTR的發(fā)生率，對于高?；颊撸瑮l件允許的情況下，應(yīng)該優(yōu)先考慮采用相容性血小板輸注。一旦發(fā)生嚴(yán)重的免疫性PTR，難以找到相容供者血小板，臨床救治困難。這種情況下，應(yīng)該轉(zhuǎn)變血小板輸注管理模式，不是試圖確保配型相合的血小板，而是消除HLA/HPA抗體?？梢詤⒖寄I移植前HLA抗體陽性患者和自身免疫疾病患者的治療方案，如大劑量丙種球蛋白靜注、利妥昔單抗或者血漿置換等方法[17，18]。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突