實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在白酒釀造過(guò)程中微生物數(shù)量檢測(cè)的應(yīng)用展望

程平言，路 虎，胡 峰，涂華彬

（貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州習(xí)水 564622）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)于1996 年由美國(guó)Applied Biosystems 公司開(kāi)發(fā)，相對(duì)于傳統(tǒng)PCR 技術(shù)，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR 從定性到定量的質(zhì)的飛躍，而且比傳統(tǒng)PCR 技術(shù)具有更強(qiáng)的特異性，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，更由于其在定量方面的準(zhǔn)確性和自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，已在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1]。但是，目前為止，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在白酒釀造過(guò)程中微生物檢測(cè)方面的研究較少，而采用傳統(tǒng)微生物計(jì)數(shù)的方法并不能真實(shí)有效的反映發(fā)酵體系中微生物的種類和數(shù)量。如若采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法，則可以實(shí)時(shí)、快速、簡(jiǎn)便的對(duì)發(fā)酵體系中的微生物進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[2]。在熒光定量PCR 中，有一個(gè)很重要的參數(shù)：Ct 值。C 是Cycle 的縮寫(xiě)，t 是threshold 的縮寫(xiě)，Ct值的意義是反映管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定閾值時(shí)經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)。經(jīng)研究[3]表明，每個(gè)模板的Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越大，Ct 值越小。如此便可以通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品建立熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣檢測(cè)到未知濃度的基因組的Ct值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以推算該基因組的起始濃度。

2 熒光檢測(cè)方法

目前最常用于熒光信號(hào)檢測(cè)的一般可分為3種類型：

一是熒光染料的方法，目前熒光染料應(yīng)用最廣泛的是SYBR GreenⅠ，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系中，添加過(guò)量的SYBR GreenⅠ染料，它能特異性的結(jié)合到DNA 雙鏈的小溝上從而產(chǎn)生熒光信號(hào)[4]，沒(méi)有結(jié)合雙鏈的SYBR GreenⅠ 是不產(chǎn)生熒光信號(hào)的。添加熒光染料進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法最大的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單易操作，但是由于SYBR GreenⅠ 能結(jié)合到所有DNA 的雙鏈上，如果PCR 反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，此方法的定量準(zhǔn)確性就會(huì)降低。不過(guò)，我們可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的一些分析軟件查看最后PCR 產(chǎn)物的溶解曲線來(lái)進(jìn)行分析。

二是雙標(biāo)記探針?lè)?，此方法的原理是通過(guò)標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物。目前在此方法體系中應(yīng)用最廣泛的為T(mén)aqMan探針。TaqMan 探針也是一寡核苷酸，其5'端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)。當(dāng)此探針不結(jié)合到DNA 上時(shí)，檢測(cè)不到5'端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光[5]。但是當(dāng)PCR 褪火時(shí)，引物與探針開(kāi)始與模板結(jié)合，此時(shí)5'端熒光基團(tuán)將會(huì)脫離出來(lái)進(jìn)入到反應(yīng)體系中，由于不再受到3'端淬滅基團(tuán)的干擾，從而可以產(chǎn)生熒光信號(hào)，進(jìn)而能被儀器檢測(cè)到。此方法中，每結(jié)合一個(gè)模板就會(huì)有一個(gè)熒光信號(hào)產(chǎn)生，就能實(shí)現(xiàn)PCR 過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

三是分子信標(biāo)法，分子信標(biāo)指的是一種形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針，呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)屏蔽，當(dāng)探針與模板結(jié)合時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，呈現(xiàn)一種線性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的物理距離增加，熒光信號(hào)不再屏蔽[6-7]，進(jìn)而可以被檢測(cè)到。

雙標(biāo)記探針?lè)ê头肿有艠?biāo)法原理[8]如圖1所示。

3 待擴(kuò)增序列的選擇

PCR 的擴(kuò)增序列一般從兩方面來(lái)考慮：一方面是從16S rDNA[9]，一方面是從功能基因[10]。16S rDNA 上一般含有穩(wěn)定的保守序列，其含量的多少可以用來(lái)表征某一類微生物的基因組含量。目前擴(kuò)增16S rDNA 應(yīng)用比較廣泛，在土壤微生物、食品微生物、醫(yī)學(xué)等方面都得到極大的應(yīng)用[11-12]。功能基因是指某一類微生物具有相同的化合物的合成生理特性，而具有相同的功能基因序列[13]，所以也可以對(duì)其功能基因進(jìn)行定量來(lái)表征某一類微生物的基因組含量。

4 基因組提取方法

根據(jù)是否在提取基因組前將微生物從環(huán)境中分離出來(lái)，可分為原位破碎和異位破碎[14-15]。原位破碎是指直接對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行細(xì)胞破碎，進(jìn)而進(jìn)行分離純化。異位破碎是指先將微生物從環(huán)境中分離出來(lái)，再進(jìn)行細(xì)胞破碎，進(jìn)而提取微生物基因組。

無(wú)論是原位破碎還是異位破碎，目的都是要將環(huán)境微生物細(xì)胞壁破碎，進(jìn)而對(duì)基因組進(jìn)行分離和純化。破壁方法[16-18]目前應(yīng)用較多的就是溶菌酶破碎、玻璃珠破碎、液氮研磨破碎等。

一般原位破碎法比異位破碎法提取到的基因組濃度要高。作者曾經(jīng)對(duì)大曲中微生物基因組提取方法進(jìn)行研究，結(jié)果如2 圖所示。

從圖2 可以明顯看出，異位破碎方法提取到的基因組濃度明顯要低于原位破碎法。雖然異位破碎法得到的基因組濃度較低，但是所得基因組純度卻是最高的。對(duì)所得基因組進(jìn)一步進(jìn)行熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，分析擴(kuò)增效率，若是基因組純度對(duì)擴(kuò)增效率影響不大，則可以選擇原位破碎法進(jìn)行大曲微生物基因組提取。

5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在白酒釀造過(guò)程中的應(yīng)用前景

白酒釀造過(guò)程中微生物種類復(fù)雜多樣，并且不同微生物的數(shù)量也是在不斷變化的。有研究表明，采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)的方法能檢測(cè)到的環(huán)境微生物僅占總體的1%左右[19]。如果采用傳統(tǒng)微生物的研究方法不能及時(shí)有效的反映出白酒釀造過(guò)程中不可培養(yǎng)微生物的種類和數(shù)量的變化，而采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法則可能會(huì)得到理想的結(jié)果。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法的局限在于必須明確所要研究微生物的待擴(kuò)增序列[20]，進(jìn)而進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，而白酒釀造過(guò)程中微生物種類復(fù)雜，想要明確所有微生物的擴(kuò)增模板，尚存在困難。但是，隨著分子技術(shù)及手段的不斷發(fā)展，這些問(wèn)題都能夠得到解決。相信在將來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在白酒微生物檢測(cè)方面將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。