糖尿病小鼠視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)分離鋪片技術(shù)的改進(jìn)與注意事項(xiàng)

姜逸，胡娜，袁琳，方龍娟，林敏，陸敏，鐘霄毓，陸雄

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，以及全球致盲的主要因素之一[1]。糖尿病小鼠能有效的模擬DR 的典型特點(diǎn)，而且方便進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作，因此普遍被用于DR 研究[2]。視網(wǎng)膜消化鋪片是研究DR 的關(guān)鍵技術(shù)之一，這種方法可以在細(xì)節(jié)上研究視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)[2]。但是關(guān)于視網(wǎng)膜消化鋪片技術(shù)，由于酶的濃度、消化方法、溫度、固定時(shí)間、吹打方法的不同，導(dǎo)致脈管系統(tǒng)分離存在一定難度。本研究意在通過不同的實(shí)驗(yàn)條件的摸索，探討相對(duì)穩(wěn)定的糖尿病小鼠視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)分離鋪片方法以及實(shí)驗(yàn)過程中的關(guān)鍵注意事項(xiàng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J 雄性小鼠40 只，6 周齡，體重20～25 g，來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心二樓SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室層流架內(nèi)飼養(yǎng)，5 只/籠，溫度：（22±2）℃，相對(duì)濕度：（55±5）%，照明：12 h（開燈時(shí)間7:00～19:00，關(guān)燈時(shí)間19:00～7:00），自由飲水飲食。實(shí)驗(yàn)小鼠的喂養(yǎng)和使用遵循上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)規(guī)定 （批準(zhǔn)文號(hào)：PZSHUTCM19012504）。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）（美國Sigma 公司，批號(hào)：S0130）；檸檬酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180202）；二水合檸檬酸三鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180119）；Tris 乙磺酸（德國Biofroxx 公司，批號(hào)：1115GR500）；鹽酸（HCL）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20131118）；胰蛋白酶（Trypsin）1:250 （德國Biofroxx 公司，批號(hào)：EZ2921B401）；胃蛋白酶（Pepsin）1:3000、1:12000（大連美倫生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：M0210A）；伊紅和蘇木素 （上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑技術(shù)有限公司，批號(hào)：181024）；羅康全活力型血糖檢測儀（Accu-chek Active）（德國羅氏診斷公司）；血糖試紙（德國羅氏診斷公司，批號(hào)：24678121）；低溫培養(yǎng)箱（美國Torrey Pines IN30-2）；搖床（美國Labnet S2025-230V）；DME 光學(xué)顯微鏡（香港徠卡儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立 將C57BL/6J 雄性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組與糖尿病模型組各20 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，正常組小鼠按55 mg/kg 的劑量腹腔注射PH 4.4，濃度0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（配制方法：檸檬酸2.1 g 加入蒸餾水100 ml 中配成A 液，二水合檸檬酸三鈉2.94 g 加入蒸餾水100 ml中配成B 液，A、B 液按1：1 混合，測定PH 值并調(diào)整至4.4 左右，0.22 μm 濾膜過濾后使用）；模型組小鼠按同等劑量腹腔注射2%STZ 溶液（使用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液現(xiàn)配避光使用）。連續(xù)注射5 d。模型組末次注射STZ 溶液后第10 d，檢測空腹血糖，平均值為351 mg/ml，血糖＞250 mg/ml 即為成模[3]。成模后2組均正常飼養(yǎng)于SPF 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，3 個(gè)月后同時(shí)取材。

1.3.2 眼球取材及固定單手固定小鼠背部，拇指和食指輕壓小鼠頸部，使小鼠眼球凸起，另一手用彎頭鑷子固定眼球根部視神經(jīng)，快速取出眼球，置于液氮中冷凍。取材成功后脫頸椎處死。眼球轉(zhuǎn)移至-80℃環(huán)境下保存。

1.3.3 固定方法 （1）眼杯固定法（24 h）：取出凍存的眼球，用一次性不銹鋼雙面刀片自睫狀體平坦部后面（近鋸齒緣）切除角膜，將眼球后段（含視神經(jīng)）用4%多聚甲醛固定液固定24 h，條件4℃；（2）眼杯固定法（12 h）：眼杯制作同（1），4%多聚甲醛固定液固定12 h，條件4℃；（3）整只眼球固定法（12 h），將整只眼球在4%多聚甲醛固定液中固定12 h，條件4℃。消化前再切除角膜。

1.3.4 視網(wǎng)膜分離及漂洗 取培養(yǎng)皿（100 mm）裝入適量蒸餾水，放入固定好的眼杯（或整只眼球）。用兩支彎頭鑷子，一支固定眼杯根部視神經(jīng)，另一只輕壓眼杯，擠出玻璃體，隨之再擠出視網(wǎng)膜。用大頭針尖固定好視網(wǎng)膜中心，眼科剪將視網(wǎng)膜平均剪切成3瓣。然后將其放在搖床上蒸餾水漂洗2 次，每次30 min。直到視網(wǎng)膜顏色由微黃變白，如沒有變白可適當(dāng)延長漂洗時(shí)間，以防固定液殘留影響染色。

1.3.5 視網(wǎng)膜消化方法 （1）3%、5%、8%胰蛋白酶（1：250）用0.1 M Tris-HCl（pH 7.8）緩沖液配制，消化液提前置于烘箱37℃預(yù)熱10 min，每組視網(wǎng)膜給予預(yù)熱后的消化液6 ml（六孔板每孔或35 mm 培養(yǎng)皿），37℃烘箱，搖床消化，隔1 h 更換一次胰蛋白酶消化液，更換時(shí)蒸餾水漂洗，吹打殘余組織，消化過程為2～5 h；（2）1%、3%、5%胃蛋白酶（1:12000）+3%胰蛋白酶（1：250）聯(lián)合消化，1%、3%、5%胃蛋白酶用0.2%HCl 配制，配好的消化液提前置于烘箱37℃預(yù)熱10 min，每組先給予6 ml 胃蛋白酶，消化視網(wǎng)膜至其明顯透明、松散，肉眼可見絮狀物飄出。然后轉(zhuǎn)移至蒸餾水漂洗，吹打殘余組織，繼續(xù)用3%胰蛋白酶消化1～4 h。消化結(jié)束后，將視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移至蒸餾水中，用1 ml 移液槍（膠頭滴管）吹打，用力輕巧均勻，直至視網(wǎng)膜完全清透，僅存網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

1.3.6 鋪片用膠頭滴管將蒸餾水中的脈管網(wǎng)吸出，滴在粘附型載玻片上（載玻片上先滴1 滴蒸餾水），利用水的張力，使脈管自然張開，以便平鋪在載玻片上。用定性濾紙吸除周邊水分，然后將載玻片放入37℃烘箱，烘干備染（也可室溫自然干燥）。

1.3.7 HE 染色視網(wǎng)膜血管鋪片，無水乙醇浸泡5 s，更換試劑重復(fù)一次；95%乙醇浸泡5 s，更換試劑重復(fù)一次；蒸餾水換洗3 次；蘇木素浸泡10 min；蒸餾水換洗3 次；1%鹽酸酒精分化30 s；70℃水藍(lán)化處理；伊紅染液3 min；95%乙醇浸泡5 s，更換試劑重復(fù)一次；無水乙醇浸泡5 s，更換試劑重復(fù)一次；二甲苯浸泡5 s，更換試劑重復(fù)一次。自然晾干，中性樹脂封片。

1.4 觀察指標(biāo)及內(nèi)容

觀察不同實(shí)驗(yàn)方法處理下小鼠視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)與周圍連接組織的分離情況：（1）樹枝狀脈管系統(tǒng)是否充分暴露，是否殘留纖維結(jié)締組織和其他細(xì)胞；（2）脈管系統(tǒng)形態(tài)是否正常，結(jié)構(gòu)是否清晰完整。

觀察正常組與模型組小鼠視網(wǎng)膜非細(xì)胞性毛細(xì)血管、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間數(shù)量與形態(tài)上的差異：（1）與正常組小鼠相比，模型組小鼠非細(xì)胞性毛細(xì)血管是否增多；（2）與正常組小鼠相比，模型組小鼠內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞數(shù)量是否減少，周細(xì)胞有無偏離血管現(xiàn)象。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2 組間獨(dú)立樣本比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同固定方法的比較

（1）眼杯固定法（24 h）：視網(wǎng)膜硬化明顯，剝離時(shí)受外力易碎，無法完成后續(xù)操作；（2）眼杯固定法（12 h）：雖可剝離出完整的視網(wǎng)膜，但由于固定前小鼠眼球未硬化，眼球小而光滑，切開角膜操作較難容易損失部分視網(wǎng)膜；（3）整體眼球固定（12 h）：足以發(fā)揮固定效果，硬化后角膜容易切開，分離后易于獲得相對(duì)大而完整的視網(wǎng)膜（表1）。

表1 不同固定方法結(jié)果

2.2 兩種消化方法的比較

（1）胰蛋白酶消化法：3%和5%胰蛋白酶，消化殘存組織過多，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和其他細(xì)胞，還有部分纖維結(jié)締組織均不能消化透徹，光鏡下大部分區(qū)域組織完整，無法觀察到暴露的視網(wǎng)膜血管 （圖1A、1B）；8%胰蛋白酶消化，在未施加外力吹打的情況下，光鏡下組織明顯“破開”、松散，露出藏于組織里的脈管網(wǎng)（圖1C）。蒸餾水中用1 ml 移液槍反復(fù)吹打，借助細(xì)密的水流沖擊，消化松散的組織可完全脫落，肉眼可見薄而清透的脈管網(wǎng)，HE 染色后可見清晰完整的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)呈樹枝枝樣分布，內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞清晰可見。（2）胃-胰蛋白酶聯(lián)合消化法：5%胃蛋白酶消化30 min 后，消化液內(nèi)飄出大量絮狀碎片，視網(wǎng)膜明顯變小，稍稍施加外力（如用膠頭滴管轉(zhuǎn)移至蒸餾水），便崩解破碎。3%胃蛋白酶情況與5%相似，胃蛋白酶消化后，撈片困難，基本無法聯(lián)合3%胰蛋白酶繼續(xù)消化。殘余視網(wǎng)膜鋪片后，光鏡下脈管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)完全破壞，只剩殘余結(jié)締組織。1%胃蛋白酶消化30 min 后，培養(yǎng)皿內(nèi)絮狀物飄出，視網(wǎng)膜明顯變薄變透，能保持視網(wǎng)膜瓣完整。但聯(lián)合3%胰蛋白酶消化1 h 后，HE 染色光鏡下血管結(jié)構(gòu)依然遭到嚴(yán)重破壞（圖1D-1F、表2）。

2.3 8%胰蛋白酶消化獲得視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)正常組與模型組形態(tài)學(xué)比較

此條件制備的小鼠視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)在HE 染色后，光學(xué)顯微鏡下血管束暴露充分，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞清晰可見。與正常組相比，模型組出現(xiàn)較多非細(xì)胞性毛細(xì)血管（t=2.668，P=0.024），內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞減少，偏離毛細(xì)血管的周細(xì)胞增多（圖2）。

表2 不同視網(wǎng)膜消化方法結(jié)果

3 討論

圖1 不同消化方法組織形態(tài)圖（×400）。1A、1B 3%和5%胰蛋白酶消化法，可見視網(wǎng)膜脈管樹枝樣結(jié)構(gòu)，但其他細(xì)胞殘留過多；1C 8%胰蛋白酶化法，無其他組織殘留，脈管系統(tǒng)清晰、完整；1D-1F 1%、3%、5%胃蛋白酶聯(lián)合3%胰蛋白酶消化法，光鏡下未見血管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞，僅殘留纖維結(jié)締組織

圖2 正常組和模型組HE 染色后脈管系統(tǒng)形態(tài)圖（×400）。2A 正常組，光鏡下未見非細(xì)胞性毛細(xì)血管，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞清晰可見；2B 模型組，光鏡下可見較多非細(xì)胞性毛細(xì)血管（黑箭頭），內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞減少

糖尿病是最常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，DR是糖尿病較為常見的并發(fā)癥之一[4]。當(dāng)糖耐量異常，繼發(fā)視網(wǎng)膜損害，產(chǎn)生缺血、缺氧，導(dǎo)致眼底周圍細(xì)胞受到損傷、血管微循環(huán)障礙、血管壁和血液流變學(xué)特性發(fā)生改變，并誘導(dǎo)新生血管的形成這一系列病理改變，從而造成視力殘疾甚至失明。

本實(shí)驗(yàn)采用STZ 誘導(dǎo)的C57 小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。一方面，STZ 可直接造成胰島β 細(xì)胞損傷，導(dǎo)致胰島素分泌不足而成功誘導(dǎo)糖尿病，重復(fù)性和成功率較高；另一方面，相對(duì)其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，小鼠與人類基因具有較高同源性，造模后可有效模擬DR 的典型特點(diǎn)，同時(shí)具備成本低、體積小易操作的優(yōu)勢。故而本實(shí)驗(yàn)采用STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠進(jìn)行DR 的相關(guān)研究。

通過小鼠視網(wǎng)膜血管分離及鋪片技術(shù)，可以直觀的看到糖尿病視網(wǎng)膜微血管結(jié)構(gòu)，細(xì)胞狀態(tài)及病理狀態(tài)下的增生及改變，且成本低廉，對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究是非常有意義的[5-6]。目前，國內(nèi)外已有許多研究采用了這種技術(shù)，但細(xì)節(jié)描述過于粗糙，對(duì)于初次探索的研究者來說有一定困難。也有一些學(xué)者發(fā)表了類似文章，介紹這種技術(shù)的具體操作，但仍然存在一些問題，一是年代久遠(yuǎn)，細(xì)節(jié)無法考證；二是大多實(shí)驗(yàn)對(duì)象是糖尿病大鼠，大鼠和小鼠眼球?qū)嶋H差異較大[7-9]。筆者在探索這一技術(shù)的過程中，通過多種實(shí)驗(yàn)方法，探索出適用于糖尿病小鼠視網(wǎng)膜消化鋪片的穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)條件。

3.1 固定時(shí)間

有研究表明在進(jìn)行視網(wǎng)膜血管消化鋪片前，組織至少要固定48 h 以上。甚有結(jié)果顯示4%甲醛固定2d 和3 個(gè)月成片效果相同[10-11]。在Cogan 和Kuwabara的報(bào)道中[8]，已成功分離出在福爾馬林固定液（5%～10%甲醛）中浸泡多年的眼球視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，認(rèn)為福爾馬林固定時(shí)間對(duì)后續(xù)消化沒有影響。初期本實(shí)驗(yàn)使用4%多聚甲醛固定24 h，切開角膜以便固定液充分浸潤視網(wǎng)膜。然而使用這種方法固定，分離出來的視網(wǎng)膜硬化、轉(zhuǎn)移過程中極為易碎，不利于后續(xù)操作。遂縮短為12 h，切開角膜固定眼杯。操作幾次后發(fā)現(xiàn)，由于固定前切開角膜取眼杯，眼球未硬化，分離角膜容易損傷內(nèi)里的視網(wǎng)膜，不利于獲取完整的、相對(duì)較大的視網(wǎng)膜。最后考慮到文獻(xiàn)所載固定方法多為糖尿病大鼠眼球，與其相比小鼠眼球體積小、組織薄，固定液易于浸潤到眼球內(nèi)，最終改為4%多聚甲醛整體固定12 h，硬化后切開分離，操作簡便，視網(wǎng)膜完整，為后續(xù)消化出視網(wǎng)膜血管爭取到更大的操作范圍。

3.2 消化方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前查閱相關(guān)文獻(xiàn)，諸多研究報(bào)道，胃-胰蛋白酶聯(lián)合消化最佳[12-15]，但每篇文獻(xiàn)報(bào)道的聯(lián)合消化時(shí)間不同，且常用胃蛋白酶有兩種不同的酶活性3000 U/g 和12000 U/g。最初我們采取3%胰蛋白酶（1:250）單獨(dú)消化和5%胃蛋白酶（1:3000）+3%胰蛋白酶(1:250)聯(lián)合消化法進(jìn)行對(duì)比，以確定最佳消化方法。在整體消化時(shí)間一樣的情況下，聯(lián)合消化法與3%胰蛋白酶單獨(dú)消化相比沒有任何優(yōu)勢。于是使用酶活性更高的5%胃蛋白酶（1:12000）聯(lián)合消化，胃蛋白酶消化以30 min 為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，觀察視網(wǎng)膜狀態(tài)。然而實(shí)際觀察30 min 后，視網(wǎng)膜瓣崩解破碎，無法撈片完成后續(xù)操作。后胃蛋白酶（1:12000）濃度降低至3%消化30 min，情況同前，無法保持視網(wǎng)膜瓣完整，勉強(qiáng)撈片完成后續(xù)操作，消化過度僅殘留結(jié)締組織而無血管結(jié)構(gòu)。最后降低至1%消化30min，視網(wǎng)膜瓣明顯變薄，但整體完整，消化1 h 后肉眼見視網(wǎng)膜薄而清透，為防止同前消化過度破壞結(jié)構(gòu)，遂漂洗后繼續(xù)聯(lián)合胰蛋白酶消化1 h。結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)明顯被破壞。本結(jié)果與何潔等[13]的報(bào)道不一致，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象不同，大鼠視網(wǎng)膜組織較厚，而糖尿病小鼠視網(wǎng)膜相比大鼠要單薄的多，組織結(jié)構(gòu)極易被胃蛋白酶破壞所致。

因此，放棄了胃-胰蛋白酶聯(lián)合消化的方法，采用胰蛋白酶單獨(dú)消化法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3%胰蛋白酶消化效率低，4 h 后才觀察到視網(wǎng)膜變輕薄透明，且消化液清澈無文獻(xiàn)所強(qiáng)調(diào)的“消化液明顯變渾濁即可停止消化”。染色后光鏡下觀察，組織殘留過多，無血管暴露。5%胰蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)也沒有很好的改善這種情況。直到我們將胰蛋白酶濃度提高到8%才發(fā)現(xiàn)消化液變得渾濁（內(nèi)含破碎的組織），消化時(shí)間在2～2.5 h 最佳。光鏡下，對(duì)比3%、5%、8%胰蛋白酶HE 染色結(jié)果，3%、5%沒有暴露血管網(wǎng)，只有8%胰蛋白酶組，組織有明顯“破開”，局部暴露清晰的血管網(wǎng)。最后確定8%胰蛋白酶為最佳消化濃度。

3.3 消化時(shí)間及其他關(guān)鍵注意事項(xiàng)

雖然8%胰蛋白酶初步展現(xiàn)出消化優(yōu)勢，但僅暴露局部，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。如何使消化后變疏松的組織完全脫離血管網(wǎng)，而又不破壞血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)成為最為一個(gè)關(guān)鍵問題。由于不同視網(wǎng)膜不同部位厚薄有差異，分割后在無人為干預(yù)的情況下消化相同時(shí)間，狀態(tài)卻不相同。因此消化過程無法準(zhǔn)確設(shè)定為完全一致的時(shí)間，而需人為的參與觀察待視網(wǎng)膜明顯輕薄后結(jié)束，整體時(shí)間一般在2～2.5 h。如若消化時(shí)間少于2 h，組織殘留多而致密，人為吹打也無法暴露血管；超過3 h，視網(wǎng)膜瓣過度消化，周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁破壞殆盡，光鏡下只見組織殘留而不見血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)。在此過程中一定要控制好消化溫度。因?yàn)橐鹊鞍酌傅拇呋磻?yīng)速度隨著溫度升高而加快，達(dá)到最適工作溫度37℃時(shí)可最大發(fā)揮消化作用，而超過這個(gè)溫度后活性逐漸降低直至完全失活。另外高溫本身就會(huì)破壞脆弱的視網(wǎng)膜瓣。

此前實(shí)驗(yàn)采用膠頭滴管吹打，膠頭滴管的吹吸力度全憑人為控制，存在用力較難均勻，吹吸水流大，容易破壞消化后的視網(wǎng)膜瓣的一系列問題。但如若不施加吹吸這一操作，僅靠消化無法使殘留的組織脫落。1 ml 移液槍可以很好解決膠頭滴管的缺陷，吹打時(shí)出水細(xì)密均勻，能夠很好地將疏松的組織帶離血管網(wǎng)，且不會(huì)破壞血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)。需要注意的是，吹打時(shí)槍頭不能觸碰視網(wǎng)膜，以免造成不可逆的結(jié)構(gòu)破壞。8%胰蛋白酶消化，每隔1 h 配合移液槍吹打，分離視網(wǎng)膜進(jìn)行HE 染色后又出現(xiàn)了消化過度的問題，光鏡下未顯示血管壁，僅見周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的核仁。因此設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)，縮短時(shí)間，整體消化2 h獲得最佳結(jié)果。

總之，本實(shí)驗(yàn)為糖尿病小鼠視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)分離鋪片確立了一種穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)條件，希望對(duì)相關(guān)疾病研究的科研工作者們有所幫助。