亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與同型半胱氨酸水平的相關(guān)性

唐慧榮，馬舉娟，陳瑞祥

作者單位：1云南省第三人民醫(yī)院藥劑科，云南 昆明650011；2大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理671000

同型半胱氨酸（Hcy）水平升高是多種疾病發(fā)生的獨立危險因素。有研究表明，Hcy水平每升高5 mmol/L，缺血性心臟病的發(fā)生風(fēng)險增加32%，Hcy水平每降低3 mmol/L，缺血性心臟病的發(fā)生風(fēng)險降低16%［1］；Hcy≥16 mmol/L的腦卒中病人，其病死率和復(fù)發(fā)率是Hcy正常病人的1.47倍和1.31倍［2］。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它能夠催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，為Hcy再甲基化為甲硫氨酸提供甲基，并維持體內(nèi)正常的Hcy水平。當MTHFR基因發(fā)生突變，可使體內(nèi)MTHFR酶活性下降，Hcy發(fā)生再甲基化途徑受阻，造成Hcy在體內(nèi)蓄積，進而引發(fā)高Hcy血癥［3］。MTHFR C677T是目前發(fā)現(xiàn)MTHFR最常見的突變位點［4］，存在CC、CT、TT三種基因型，有研究表明，TT基因型可增加高Hcy血癥的發(fā)病風(fēng)險［5］。MTHFR C677T基因在不同國家、地區(qū)、民族的分布具有明顯差異：歐洲人群的T等位基因分布較多（24.5%～43.8%），亞洲居中（2.5%～36%），非洲最低（4.9%～9.1%）［6］。因此，通過研究不同地域人群MTHFR C677T基因多態(tài)性以及與Hcy水平的相關(guān)性，將有助于該地區(qū)人群在疾病發(fā)生前后采取有效的預(yù)防和治療措施。目前國內(nèi)外關(guān)于MTHFR C677T基因多態(tài)性的地域分布以及與Hcy相關(guān)性的報道很多，但云南地區(qū)還未見有大數(shù)據(jù)的相關(guān)研究。本研究通過探討985例云南地區(qū)人群MTHFR C677T基因分布特征及其與Hcy水平的相關(guān)性，旨在為本地區(qū)人群預(yù)防和治療MTHFR C677T基因突變引起的高Hcy血癥及其相關(guān)疾病提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2018年1月至2019年3月就診于云南省第三人民醫(yī)院并進行MTHFR C677T基因檢測的985例漢族人群（包括住院病人559例、體檢人群426例）作為研究對象，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

入選標準：在該院進行MTHFR C677T基因檢測并在云南省長期居住的漢族人群，研究個體間無血緣關(guān)系。排除標準：檢測Hcy水平前2周曾服用或目前正在服用葉酸、B族維生素類或復(fù)合維生素藥物的病人；合并腫瘤、肝、腎功能不全者；甲狀腺功能異常者。

1.2方法

1.2.1分組 將所有研究對象按照基因型分為CC、CT、TT三組進行分析，并按照年齡分為青年組（＜45歲）、中年組（45～60歲）與老年組（＞60歲）；由于高Hcy血癥的診斷目前還沒有統(tǒng)一標準，因此本研究按照Hcy水平分為正常組（5～10 mmol/L），臨界組（＞10～15 mmol/L），高Hcy組（＞15 mmol/L）。

1.2.2數(shù)據(jù)收集 本研究收集數(shù)據(jù)包括：①人口學(xué)數(shù)據(jù)：姓名、性別、年齡、體質(zhì)量、民族、職業(yè)等；②既往病歷資料：包括家族史，既往病史及現(xiàn)病史，用藥情況（是否服用過葉酸、B族維生素類藥物）；③相關(guān)實驗室檢查：Hcy檢測結(jié)果。去除個人標識信息。

1.2.3MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測

1.2.3.1樣本采集 要求受檢者清晨空腹狀態(tài)下（采血前一天晚餐后至第2天早上采血前禁食8～14 h），取坐位，采集肘靜脈血，約3～5 mL，加至EDTA抗凝管中，并充分混勻，避免凝血或溶血，立即放置于-20℃冰箱保存，用于測定MTHFR C677T基因多態(tài)性。

1.2.3.2全血DNA提取 實驗前準備：打開金屬浴，設(shè)置為56℃；從2～8℃冰箱中取出核酸提取試劑盒，向緩沖液BW1中加入5 mL無水乙醇、向緩沖液BW2中加入7 mL無水乙醇，并做標記。隨后進行①活化吸附柱、②裂解細胞、③洗滌。

洗脫獲得DNA：取1.5 mL離心管，將吸附柱插入其中，棄去裝廢液的收集管，向吸附柱膜中間位置懸空滴加60 mL洗脫液BE，蓋緊蓋子，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min（DNA樣本-20℃保存1個月，期間反復(fù)凍融不超過3次）。

1.2.3.3PCR-芯片雜交法檢測MTHFR C677T基因型 PCR擴增：-20℃冰箱中取出試劑（擴增液，反應(yīng)液A）放置室溫，低速離心；將新開啟的擴增液進行冰上分裝（擴增液忌反復(fù)凍融）：取12個0.2 mL的PCR管，每管分裝22 mL，留用實驗所需數(shù)量的擴增液，其余放入-20℃冰箱保存（用于之后實驗按需取出相應(yīng)數(shù)量分裝好的擴增液）；在PCR管蓋上進行樣本編號；在各擴增管中依次加入1 mL反應(yīng)液A，2 mL提取好的DNA樣品溶液，混勻；將各擴增管放入PCR儀中，按下列條件進行擴增：50℃5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min；取出擴增產(chǎn)物，2～8℃保存。

芯片雜交顯色：-20℃冰箱中取出反應(yīng)液B，室溫解凍后，低速離心，取10 mL加入雜交緩沖液中，做好標記，在手中轉(zhuǎn)動混勻；-20℃冰箱中取出抗體和抗體稀釋劑，將抗體和抗體稀釋劑按照1∶3 000比例混勻，12 000 r/min離心30 s，取上清液使用；從雜交顯色試劑盒中取出所需數(shù)量的8聯(lián)管，在8聯(lián)管圓頭的側(cè)壁標注樣本編號并放置于試劑架上；吸取190 mL雜交緩沖液加入其中，再加入10 mL擴增液的擴增產(chǎn)物，吸打混勻；加入200 mL抗體；加入200 mL顯色液；-20℃冰箱中取出MTHFR基因芯片，將芯片與8聯(lián)管依次放入雜交儀中，加載雜交程序，進行雜交反應(yīng)。

讀取結(jié)果：使用生物芯片識讀儀讀取結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，定量資料不服從正態(tài)分布時采用中位數(shù)（下、上四分位數(shù)）［M（P25，P75）］描述。采用χ2檢驗進行各基因組性別、年齡頻率的比較，分析MTHFR C677T基因多態(tài)性與性別、年齡的相關(guān)性；采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行組間Hcy水平總體差異的比較，采用Games-Howell檢驗進行多組間的兩兩比較，分析MTHFR C677T基因多態(tài)性與Hcy水平的相關(guān)性；采用趨勢χ2檢驗比較不同組間基因型分布頻率隨Hcy水平分層變化的趨勢。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗方法檢測樣本的群體代表性，P＞0.05說明樣本人群該基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結(jié)果

2.1985例檢測人群MTHFR C677T基因分布特征MTHFR C677T中CT基因型分布頻率相對較高49.9%（492/985），CC基因型分布頻率相對較低19.6%（193/985），TT基因型分布頻率居中30.5%（300/985）。經(jīng)檢驗，樣本人群符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2＝0.115，P＝0.944），具有群體代表性。

2.2不同性別MTHFR C677T基因分布特征男性CC、CT、TT基因型分布頻率與女性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5.88，P＝0.053），見表1。

表1 不同性別漢族人群MTHFR C677T基因型頻數(shù)和頻率分布/例（%）

2.3不同年齡MTHFRC677T基因分布特征結(jié)果顯示三種基因型在不同年齡組中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝4.33，P＝0.363），見表2。

表2 不同年齡漢族人群MTHFR C677T基因型頻數(shù)和頻率分布/例（%）

2.4MTHFR C677T基因多態(tài)性與血漿Hcy相關(guān)性

2.4.1MTHFR C677T不同基因型血漿Hcy水平比較 Hcy檢出最高濃度為86.40 mmol/L，最低濃度為5.00 mmol/L，均為CT基因型。經(jīng)正態(tài)性檢驗，血漿Hcy水平不服從正態(tài)分布，三種基因型Hcy濃度為13.50（5.55，21.45）mmol/L，CC、CT、TT基因型Hcy濃度分別為 12.30（6.73，17.87）mmol/L、12.68（7.20，18.16）mmol/L、19.04（4.11，42.19）mmol/L。經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗，不同基因型組間Hcy水平總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H＝134.96，P＜0.001），采用Games-Howell檢驗進行組間兩兩比較，結(jié)果顯示，TT基因型的Hcy水平高于CC和CT（P＜0.001），CC和CT基因型的Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4.2Hcy水平不同分層中MTHFR C677T基因分布特征 CC、CT基因型在Hcy水平臨界組（＞10～15 mmol/L）中分布頻率相對較高，TT基因型在高Hcy組（Hcy＞15 mmol/L）中分布頻率相對較高，見表3。

表3 Hcy（同型半胱氨酸）水平不同分層中漢族人群MTHFR C677T基因分布特征/例（%）

3 討論

MTHFR是Hcy代謝的關(guān)鍵酶，MTHFR基因突變可改變體內(nèi)MTHFR氨基酸結(jié)構(gòu)，使MTHFR酶活性降低，導(dǎo)致Hcy再甲基化受阻，Hcy水平升高，進而引發(fā)高Hcy血癥。MTHFR C677T是MTHFR最常見的突變位點［4］，同時MTHFR C677T基因多態(tài)性也是乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤的易感基因［7-9］，《中國高血壓防治指南2010》中將Hcy水平≥10 mmol/L列為心血管事件發(fā)生的獨立危險因素。

Frosst等［4］在1995年首次提出MTHFR核苷酸第677位胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）替換，導(dǎo)致第222位氨基酸由高度保守的丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，由此突變產(chǎn)生了CC、CT、TT三種基因型，研究表明CT基因型可使酶活性降低35%，TT基因型可使酶活性降低70%［10］。

本研究對985例云南地區(qū)人群MTHFR C677T基因多態(tài)性進行了分析，結(jié)果顯示CC型19.6%，CT型49.9%，TT型30.5%。與其他地區(qū)相比，CC基因型分布高于北方山東（14.6%）、河南（16.6%），低于天津（21.4%）、陜西（21.7%），且低于南方江蘇（32.7%）、湖北（36.2%）、四川（41.8%）、云南（42.7%）、廣東（51.3%）、海南（58.5%），TT基因型分布在北方地區(qū)高于天津和陜西（均為30.4%），低于山東（40.8%）、河南（37.0%），高于南方江蘇（19.7%）、湖北（16.8%）、四川（13.8%）、云南（15.3%）、廣東（8.3%）、海南（6.4%）［19］。上述結(jié)果表明985例云南地區(qū)人群MTHFR C677T基因多態(tài)性與其他地區(qū)相比存在地域差異性。此外，本研究中，與其他民族相比，漢族TT基因型（30.5%）分布頻率較高（布依族0.84%、苗族7.45%、回族3.42%、壯族0%、維吾爾族5.26%、蒙古族15.20%［11］），表明MTHFR C677T基因多態(tài)性分布具有民族差異性，以上結(jié)論與國內(nèi)外相關(guān)報道結(jié)論一致［12-15］。

在不同性別方面，大部分研究結(jié)論認為MTHFR C677T基因多態(tài)性不存在性別差異［11，16］，但也有個別研究得出相反結(jié)論。如吳自強、徐韞?。?7］研究結(jié)果顯示突變基因型CT、TT在女性中的分布頻率（38.7%，16.1%）均高于男性（30.2%，9.8%），（P＜0.05）。本研究中CC、CT、TT基因型分布頻率男性（67.4%，58.9%，65.7%）與女性（32.6%，41.1%，34.3%）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.053）。在不同年齡方面，本研究結(jié)果顯示：CC、CT、TT基因型在60歲及以上人群中分布頻率（47.2%，42.9%，50.0%）與在 45歲以下人群（12.9%，15.4%，14.0%）也差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.363）。此結(jié)論與任瑋等［18］研究結(jié)論相一致。

MTHFR C677T基因突變引起的Hcy水平升高是目前最常見的遺傳因素之一，并且由MTHFR C677T基因突變引起的Hcy水平變化可增加疾病的發(fā)生風(fēng)險。本研究對MTHFR C677T多態(tài)性與Hcy水平相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示：TT基因型的Hcy水平19.04（4.11，42.19）μmol/L較高，其次為CT基因型 12.68（7.20，18.16）μmol/L，CC 型 Hcy水平較低12.30（6.73，17.87）μmol/L，TT基因型與 CC、CT 型Hcy水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步對Hcy水平進行分組，結(jié)果顯示：TT基因型在Hcy水平正常組（5～10 mmol/L）、臨界組（＞10～15 μmol/L）以及高Hcy組（Hcy＞15 μmol/L）中的分布頻率分別為 9.0%、27.3%、63.7%，TT基因型的分布頻率隨著Hcy水平的升高而增大。以上結(jié)果表明MTHFR C677T多態(tài)性與Hcy水平存在關(guān)聯(lián)，并且TT基因型可能是發(fā)生高Hcy血癥的危險因素，此結(jié)論也與國內(nèi)外大部分相關(guān)研究結(jié)論一致［19-20］。