腫瘤壞死因子受體相關因子6的表達對食管鱗狀細胞癌預后的影響

楊蘭艷，殷芳，王建剛，孔娜

作者單位：云南省第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，云南 昆明650000

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其預后不良，居全球癌癥相關死因第6位［1］。西方國家大多數(shù)食管癌病理類型為腺癌，而在我國則以鱗狀細胞癌居多。隨著以手術治療為主、化療和放療為輔的綜合治療措施的出現(xiàn)，食管癌病人的生存率有所提高，但其5年總生存率仍然較低［2］。腫瘤壞死因子受體相關因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）是一種新型天冬酰胺基內(nèi)肽酶蛋白酶，具有促進蛋白質(zhì)穩(wěn)定的作用［3］，最近的研究表明TRAF6與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關［4-6］。然而國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)TRAF6與食管鱗狀細胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）復發(fā)和生存的相關性研究。本研究通過檢測TRAF6在ESCC組織中的表達及其與生存和復發(fā)的相關性，以期為ESCC的治療和預后評估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2012年12月至2014年2月在云南省第三人民醫(yī)院接受根治性切除術治療的經(jīng)病理證實為ESCC的病人作為研究對象。共有478例ESCC病人納入本研究，年齡（59.3±7.6）歲，年齡范圍為44～75歲。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求，所有研究對象在參與本研究前均已簽署知情同意書。

1.2免疫組織化學及陽性判斷標準采用10%甲醛對術中切除的新鮮的食管癌組織標本進行固定，并行常規(guī)石蠟包埋，將石蠟標本切成4 μm連續(xù)切片，60℃烤片8 h備用。將切片脫蠟和水化。采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，每次3 min。蒸餾水浸泡后行抗原修復。采用PBS 100℃修復10 min。并自然冷卻至室溫。在PBS搖床上進行2～3次沖洗，每次5 min。然后滴入過氧化氫酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min；滴加生物素標記二抗（羊抗兔IgG），室溫下孵育1 h；PBS沖洗3次，每次3 min；行DNA染色，蒸餾水沖洗后，使用蘇木素復染，酒精脫水，采用流水進行緩慢沖洗反藍，空氣干燥，中性膠封片。

由2名高級職稱病理科醫(yī)師對免疫結果進行判定［7］：在高倍鏡下，每張切片觀察15個視野。平均100個細胞中TRAF6陽性細胞的個數(shù)為陽性細胞率。細胞質(zhì)中觀察到棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞染色程度評分標準為0分：陰性；1分：淡黃色；2分：黃色；3分：棕黃色。陽性細胞百分比評分標準：0分：＜1%；1分：1%～10%；2分：＞10%～30%；3分：＞30%～60%；4分：＞60%。最終得分為細胞質(zhì)陽性細胞染色程度評分與陽性細胞百分比評分之和。最終結果判定：0～2分：陰性，3～7分：陽性。

1.3隨訪采用電話隨訪和門診隨訪相結合的方式，病人出院后每3個月隨訪1次，了解病人術后復發(fā)和生存狀況等信息，隨訪截止日期為2019年5月。478例ESCC病人中，445例完成隨訪，失訪23例，隨訪率95.2%。中位隨訪時間為33個月（范圍為5～60個月）。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。連續(xù)資料用x±s表示。分類資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。用Kaplan-Meier并Log-rank檢驗進行單因素生存分析，單因素分析差異有統(tǒng)計學意義的變量納入Cox多因素模型分析影響ESCC病人復發(fā)和死亡的獨立危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1TRAF6表達與ESCC病人臨床病例特征的關系478例ESCC病人中，341例（71.3%）符合TRAF6表達陽性標準。TRAF6陽性表達癌組織細胞質(zhì)呈淡黃色、棕黃色或棕褐色，見圖1。TRAF6表達與性別、年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05）。TRAF6表達與ESCC病人的TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、復發(fā)和死亡狀況顯著相關（P＜0.001）。淋巴結轉(zhuǎn)移、較高臨床分期、發(fā)生復發(fā)或死亡的病人TRAF6陽性表達率高。見表1。

表1 腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）表達與食管鱗狀細胞癌臨床病例特征的關系/例（%）

2.2ESCC病人單因素生存分析Kaplan-Meier并Log-rank檢驗顯示，較高TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、TRAF6陽性表達可增加ESCC病人復發(fā)風險（P＜0.001）。較高TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、復發(fā)、TRAF6陽性表達可增加ESCC病人死亡風險（P＜0.001）。結果見表2，圖2。

2.3ESCC病人多因素Cox回歸分析結果將Kaplan-Meier并Log-rank分析結果顯示差異有統(tǒng)計學意義的變量納入Cox回歸模型，結果顯示：較高TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、TRAF6陽性表達是ESCC病人復發(fā)的獨立危險因素（P＜0.001）。較高TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、復發(fā)、TRAF6陽性表達是ESCC病人死亡的獨立危險因素（P＜0.001）。見表3。

表2 食管鱗狀細胞癌445例單因素生存分析

表3 食管鱗狀細胞癌445例多因素生存分析

3 討論

近年來，雖然ESCC的治療技術取得了突破性的進展，然而其總體生存率并沒有得到顯著改善。ESCC具有家族聚集性的臨床特征，表明遺傳易感性可能在食管癌發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用［8］。然而，由于腫瘤的異質(zhì)性，具有相似臨床特征的ESCC病人預后也可能不同。因此，鑒定新的敏感和特異性分子標志物對于ESCC的早期診斷和治療非常重要。TRAF6是腫瘤壞死因子受體和白細胞介素-1受體/Toll樣受體超家族誘導信號的銜接因子，并在先天免疫反應中發(fā)揮關鍵作用［9］。動物試驗發(fā)現(xiàn)TRAF6在ESCC細胞系中表達上調(diào)，并可調(diào)節(jié)細胞生長［10-11］。然而，TRAF6對ESCC病人復發(fā)和死亡影響的研究仍然有限。

本研究發(fā)現(xiàn)TRAF6陽性表達和ESCC病人的性別、年齡、腫瘤大小無關，但與ESCC病人的TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、復發(fā)和死亡狀況顯著相關。TRAF6陽性表達陽性病人復發(fā)和死亡的風險增加。這與先前關于TRAF6對其他腫瘤病人預后影響的研究一致：TRAF6高表達與胃癌、舌癌、卵巢癌等腫瘤的不良預后相關［4-5，12］。表明TRAF6可能是ESCC復發(fā)和死亡的新型生物標志物。TRAF6可以同時調(diào)控核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）兩條信號通路。通過調(diào)控食管癌組織中NF-κB、MAPK兩條信號通路的異常激活，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的升高，可以增加食管癌化療的耐藥抵抗。MAPK家族主要包括細胞外信號調(diào)控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/應激活化蛋白激酶）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）3個信號通路。ERK和p38 MAPK均在食管癌組織中存在高表達，并影響食管癌病人的預后［13］。JNK/SAPK磷酸化后可促進食管癌組織中瘤體的生長和血管的形成，抑制JNK/SAPK的活性可抑制食管癌侵襲［14-15］。此外，抑制TRAF6的表達可顯著抑制多種腫瘤細胞的增殖和侵襲，并促進細胞周期的凋亡［13，16-18］。提示TRAF6可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的病理生理學作用。

綜上所述，TRAF6在ESCC癌組織中的表達參與ESCC的發(fā)生發(fā)展，TRAF6表達陽性病人復發(fā)和死亡的風險增加，TRAF6可作為ESCC潛在的治療靶點。

（本文圖1，2見封3）

圖1 食管鱗狀細胞癌病人癌組織中腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）表達（免疫組織化學染色×200）：A為陽性；B為陰性

圖2 腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）表達與食管鱗狀細胞癌445例生存率的相關性：A為無瘤生存率；B為總體生存率