基于缺氧誘導(dǎo)因子-1α/Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3通路探討速效救心丸對(duì)冠心病大鼠的保護(hù)機(jī)制

郭坤，金輝，吳留廣

作者單位：周口市中心醫(yī)院心臟血管外科，河南 周口466000

冠心病屬于臨床常見(jiàn)心臟疾病，近年來(lái)冠心病發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡逐漸趨向于年輕化［1］。冠心病病人病情加重可發(fā)展為心肌梗死、腦卒中等不良心血管疾病，其中心肌細(xì)胞凋亡在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）屬于缺氧反應(yīng)重要調(diào)節(jié)因子，廣泛參與細(xì)胞促凋亡或抗凋亡過(guò)程，近期研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α可介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BNIP3）由HIF-1α誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)也是心肌細(xì)重要的促凋亡蛋白因子［3］?；趯?duì)冠心病心肌細(xì)胞凋亡的認(rèn)知，HIF-1α/BNIP3可能成為冠心病的治療新靶點(diǎn)。速效救心丸由川芎、冰片、麝香、蟾酥等中藥組成，可增加冠脈血流量，在治療冠心病心絞痛方面效果較好，然而其具體藥理機(jī)制目前尚不明確［4］。本研究于2018年8月至2019年2月通過(guò)復(fù)制冠心病模型大鼠，給予速效救心丸治療，旨在探究其藥理機(jī)制，試圖為速效救心丸的臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)別SD大鼠70只，雄性，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2018-0006］，8周齡，體質(zhì)量（223.54±15.37）g。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物速效救心丸購(gòu)于天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司第六中藥廠，批號(hào)為180325；使用時(shí)將藥丸用研缽研磨成細(xì)粉狀，用雙蒸水進(jìn)行溶解，使其最終濃度為1.28 g/L［5］。HIF-1α激活劑奧替普拉（Oltipraz）購(gòu)于美國(guó)Selleck Chemicals，貨號(hào)為64224-21-1。

1.3試劑與儀器三酰甘油（批號(hào)180312）、總膽固醇（批號(hào) 180328）、高密度脂蛋白（HDL）（批號(hào)180411）、低密度脂蛋白（LDL）（批號(hào)180409）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程公司，一氧化氮檢測(cè)試劑盒［批號(hào)JK-（a）-2328］購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司；內(nèi)皮素-1（ET-1）（批號(hào)E06979r）、前列環(huán)素I2（PGI2）（批號(hào)E13706r）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)PT520）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)C0105）、TUNEL染色試劑盒（批號(hào)C1088）均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）（批號(hào)180216A）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）（批號(hào)180308A）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司；RIPA裂解液（批號(hào)EX6020）購(gòu)于金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司；BCA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)23225）購(gòu)于美國(guó)PIERCE公司；鼠抗HIF-1α（批號(hào)36169）、BNIP3（批號(hào) 44060）、Bcl-2相關(guān) X 蛋白（Bax）（批號(hào) 5023）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）（批號(hào)3700）購(gòu)于美國(guó)CST公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）（批號(hào)ab185002）、半胱氮酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）（批號(hào) ab197202）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號(hào)ab205719）購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀Synergy2購(gòu)于美國(guó)Bio-Tek公司；自動(dòng)生化檢測(cè)儀MS-18購(gòu)于澳普森公司；JVD-80垂直電泳儀購(gòu)于IBI；伯樂(lè)ChemiDoc MP型凝膠成像儀購(gòu)美國(guó)Bio-Rad公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Olymplus公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1模型制備 參考文獻(xiàn)法［6］復(fù)制冠心病大鼠，將大鼠分為健康組（n＝10）以及模型組（n＝60），模型組大鼠每日腹腔注射維生素D3，劑量為60萬(wàn)單位/kg，同時(shí)灌胃10 mL/kg脂肪乳，連續(xù)造模12周。造模結(jié)束前3 d，健康組大鼠腹腔注射1 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液，模型組大鼠腹腔注射30 U/kg垂體后葉素，間隔24 h注射1次，共注射3次，誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣，心電圖檢測(cè)以PR段為基線記錄J點(diǎn)位移，當(dāng)J點(diǎn)變化幅度超過(guò)0.1 mV視為發(fā)生心肌缺血。模型組最終40只大鼠造模成功，造模成功率為66.67%。

1.4.2動(dòng)物給藥與分組 造模結(jié)束后，將40只模型大鼠分為單純模型組，速效救心丸組、奧替普拉組、速效救心丸+奧替普拉組，每組10只大鼠。速效救心丸組：造模結(jié)束后，灌胃速效救心丸水溶液，劑量為1.28 g/kg，單純模型組：每日灌胃等量雙蒸水；奧替普拉組：造模結(jié)束后，灌胃奧替普拉，劑量為0.5 g/kg；速效救心丸+奧替普拉組：造模結(jié)束后，首先灌胃0.5 g/kg奧替普拉，15 min后灌胃1.28 g/kg速效救心丸水溶液。各組連續(xù)處理2周。

1.4.3心電圖檢測(cè) 末次給藥結(jié)束后，所有大鼠采用心電監(jiān)測(cè)儀記錄標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖變化。

1.4.4大鼠血清中血脂相關(guān)水平檢測(cè) 采集大鼠尾靜脈血1 mL，3 000 g離心5 min分離血清，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)血清總膽固醇、三酰甘油、HDL、LDL水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5血清TNF-α、MCP-1、ICAM-1水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中TNF-α、MCP-1、ICAM-1含量，嚴(yán)格按照實(shí)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.6血清一氧化氮、ET-1、PGI2水平檢測(cè) 血清一氧化氮水平測(cè)定采用硝酸還原酶法檢測(cè)，ET-1、PGI2水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.7HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化 尾靜脈血采集后將大鼠處死，獲取心肌組織，置于4%多聚甲醛中過(guò)夜固定，常規(guī)制備心肌組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、梯度乙醇脫水后，采用HE染色試劑盒對(duì)切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化情況。

1.4.8DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡情況 將心肌組織石蠟切片在二甲苯中脫蠟、無(wú)水乙醇脫水后，用蛋白酶K室溫下孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后，添加TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育1 h，PBS清洗2次，并在PBS中懸浮，采用熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，發(fā)射波長(zhǎng)為515～565 nm。采用Image-J軟件定量分析心肌細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率＝綠色熒光細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.9蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)心肌組織HIF-1α、BNIP3、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá) 將大鼠心肌組織用裂解液裂解后提取組織總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，BSA封閉后，用HIF-1α、BNIP3、Bcl-2、Bax、caspase-3一抗孵育膜，4℃過(guò)夜后添加二抗（1∶3 000）孵育膜，37℃反應(yīng)1 h，采用發(fā)光試劑盒顯色后，在凝膠成像儀內(nèi)采集圖片，采用Image-J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s描述，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩對(duì)比采用SNK-q檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1速效救心丸對(duì)大鼠心電圖ST段的影響與健康組相比，單純模型組ST段、T波明顯升高（P＜0.05）；速效救心丸組ST段、T波顯著低于單純模型組，奧替普拉組ST段、T波顯著高于單純模型組（P＜0.05）；速效救心丸+奧替普拉組ST段、T波顯著低于奧替普拉組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1健康大鼠和冠心病大鼠心電圖ST段比較/（mV，±s）

表1健康大鼠和冠心病大鼠心電圖ST段比較/（mV，±s）

注：與健康組相比，aP＜0.05；與單純模型組相比，bP＜0.05；與速效救心丸組相比，cP＜0.05；與速效救心丸+奧替普拉組相比，dP＜0.05

T波0.09±0.03 0.26±0.05a 0.15±0.04ab 0.24±0.05ac 0.35±0.03abcd 60.536＜0.001組別健康組單純模型組速效救心丸組速效救心丸+奧替普拉組奧替普拉組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 ST段0.15±0.04 0.36±0.05a 0.23±0.04ab 0.34±0.06ac 0.41±0.05abcd 47.331＜0.001

2.2速效救心丸對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響與健康組相比，單純模型組三酰甘油、總膽固醇顯著升高，HDL顯著降低（P＜0.05）。速效救心丸組三酰甘油、總膽固醇顯著低于單純模型組，HDL顯著高于單純模型組（P＜0.05）；奧替普拉組三酰甘油、總膽固醇顯著高于單純模型組，HDL顯著低于單純模型組（P＜0.05）。速效救心丸+奧替普拉組三酰甘油、總膽固醇顯著低于奧替普拉組，HDL顯著高于奧替普拉組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3速效救心丸對(duì)大鼠血清炎性因子的影響與健康組相比，單純模型組TNF-α、MCP-1、ICAM-1顯著升高（P＜0.05）。速效救心丸組TNF-α、MCP-1、ICAM-1顯著低于單純模型組；奧替普拉組TNF-α、MCP-1、ICAM-1顯著高于單純模型組（P＜0.05）。速效救心丸+奧替普拉組TNF-α、MCP-1、ICAM-1顯著低于奧替普拉組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 健康大鼠和冠心病大鼠血脂指標(biāo)水平比較/（mmol/L，±s）

表2 健康大鼠和冠心病大鼠血脂指標(biāo)水平比較/（mmol/L，±s）

注：HDL為高密度脂蛋白，LDL為低密度脂蛋白。與健康組相比，aP＜0.05；與單純模型組相比，bP＜0.05；與速效救心丸組相比，cP＜0.05；與速效救心丸+奧替普拉組相比，dP＜0.05

LDL 0.57±0.09 0.64±0.10a 0.63±0.09ab 0.62±0.13ac 0.58±0.08abcd 0.980＜0.001組別健康組單純模型組速效救心丸組速效救心丸+奧替普拉組奧替普拉組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10三酰甘油0.65±0.06 1.08±0.14a 0.85±0.07ab 1.06±0.13ac 1.27±0.12abcd 47.618＜0.001總膽固醇1.82±0.18 3.24±0.35a 2.24±0.29ab 3.16±0.37ac 3.78±0.43abcd 56.751＜0.001 HDL 1.13±0.29 0.59±0.05a 0.92±0.06ab 0.61±0.06ac 0.45±0.04abcd 40.356＜0.001

表3 健康大鼠和冠心病大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）水平比較/（pg/mL，±s）

表3 健康大鼠和冠心病大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）水平比較/（pg/mL，±s）

注：與健康組相比，aP＜0.05；與單純模型組相比，bP＜0.05；與速效救心丸組相比，cP＜0.05；與速效救心丸+奧替普拉組相比，dP＜0.05健康組

組別健康組單純模型組速效救心丸組速效救心丸+奧替普拉組奧替普拉組F值P值ICAM-1 21.03±1.89 58.58±3.41a 35.48±1.26ab 53.82±2.17ac 66.42±2.73abcd 589.332＜0.001鼠數(shù)10 10 10 10 10 TNF-α 18.57±2.15 38.27±1.36a 24.69±1.53ab 35.23±1.65ac 43.42±1.59abcd 367.933＜0.001 MCP-1 36.85±2.16 83.78±4.35a 47.25±2.28ab 78.29±4.62ac 92.39±4.84abcd 399.393＜0.001

2.4速效救心丸對(duì)大鼠血管內(nèi)皮指標(biāo)的影響與健康組相比，單純模型組一氧化氮、PGI2水平顯著降低，ET-1水平升高（P＜0.05）。速效救心丸組一氧化氮、PGI2水平顯著高于單純模型組，ET-1水平顯著低于單純模型組；奧替普拉組一氧化氮、PGI2水平顯著低于單純模型組，ET-1水平顯著高于單純模型組（P＜0.05）。速效救心丸+奧替普拉組ET-1水平顯著低于奧替普拉組，一氧化氮、PGI2水平顯著高于奧替普拉組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.5HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化健康組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊，未發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；單純模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)染色不均勻，細(xì)胞肥大，細(xì)胞核變形，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間隙變寬，心肌纖維排列紊亂，心肌纖維萎縮。與單純模型組相比，奧替普拉組心肌組織病理?yè)p傷更為嚴(yán)重，速效救心丸組心肌組織損傷明顯得到緩解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，細(xì)胞形態(tài)部分恢復(fù)正常。見(jiàn)圖1。

表4 健康大鼠和冠心病大鼠血清一氧化氮、內(nèi)皮素-1（ET-1）、前列環(huán)素I2（PGI2）水平比較/± s

表4 健康大鼠和冠心病大鼠血清一氧化氮、內(nèi)皮素-1（ET-1）、前列環(huán)素I2（PGI2）水平比較/± s

注：與健康組相比，aP＜0.05；與單純模型組相比，bP＜0.05；與速效救心丸組相比，cP＜0.05；與速效救心丸+奧替普拉組相比，dP＜0.05健康組

PGI2/（ng/L）152.52±10.69 123.63±11.23a 136.44±12.27ab 126.59±11.13ac 125.32±10.84abcd 212.847＜0.001組別健康組單純模型組速效救心丸組速效救心丸+奧替普拉組奧替普拉組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10一氧化氮/（μmol/L）42.68±2.66 28.58±1.53a 36.43±1.65ab 27.24±2.32ac 23.52±1.84abcd 143.176＜0.001 ET-1/（ng/L）4.32±0.87 11.63±1.84a 7.18±1.57ab 11.24±1.73ac 12.76±1.45abcd 53.811＜0.001

2.6速效救心丸對(duì)大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡影響與健康組（0.00±0.00）%相比，單純模型組心肌組織細(xì)胞凋亡率（46.72±4.37）%顯著升高（P＜0.05）。速效救心丸組細(xì)胞凋亡率（15.66±3.51）%顯著低于單純模型組；奧替普拉組細(xì)胞凋亡率（62.88±8.35）%顯著高于單純模型組（P＜0.05）。速效救心丸+奧替普拉組細(xì)胞凋亡率（42.76±5.16）%顯著低于奧替普拉組（F＝250.867，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

2.7速效救心丸對(duì)大鼠心肌組織HIF-1α/BNIP3通路蛋白表達(dá)的影響與健康組相比，單純模型組心肌組織HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。速效救心丸組HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)顯著低于單純模型組；奧替普拉組HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)顯著高于單純模型組（P＜0.05）。速效救心丸+奧替普拉組HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)顯著低于奧替普拉組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3，表5。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)健康大鼠和冠心病大鼠HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)情況：A為健康組；B為單純模型組；C為速效救心丸組；D為速效救心丸+奧替普拉組；E為奧替普拉組

2.8速效救心丸對(duì)大鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)的影響與健康組相比，單純模型組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。速效救心丸組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于單純模型組，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)顯著低于單純模型組；奧替普拉組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于單純模型組，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于單純模型組（P＜0.05）。速效救心丸+奧替普拉組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于奧替普拉組，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于奧替普拉組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4，表6。

表5 健康大鼠和冠心病大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BNIP3）蛋白表達(dá)比較/± s

表5 健康大鼠和冠心病大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BNIP3）蛋白表達(dá)比較/± s

注：β-actin為β-肌動(dòng)蛋白。與健康組相比，aP＜0.05；與單純模型組相比，bP＜0.05；與速效救心丸組相比，cP＜0.05；與速效救心丸+奧替普拉組相比，dP＜0.05健康組

BNIP3/β-actin 0.19±0.04 0.32±0.03a 0.26±0.03ab 0.36±0.04ac 0.46±0.06abcd 60.581＜0.001組別健康組單純模型組速效救心丸組速效救心丸+奧替普拉組奧替普拉組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 HIF-1α/β-actin 0.35±0.04 1.12±0.15a 0.49±0.06ab 1.06±0.17ac 1.37±0.26abcd 76.799＜0.001

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)健康大鼠和冠心病大鼠Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)情況：A為健康組；B為單純模型組；C為速效救心丸組；D為速效救心丸+奧替普拉組；E為奧替普拉組

表6 健康大鼠和冠心病大鼠心肌組織中Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、半胱氮酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）蛋白表達(dá)比較/± s

表6 健康大鼠和冠心病大鼠心肌組織中Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、半胱氮酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）蛋白表達(dá)比較/± s

注：β-actin為β-肌動(dòng)蛋白。與健康組相比，aP＜0.05；與單純模型組相比，bP＜0.05；與速效救心丸組相比，cP＜0.05；與速效救心丸+奧替普拉組相比，dP＜0.05健康組

caspase-3/β-actin 0.31±0.03 0.54±0.05a 0.42±0.04ab 0.52±0.06ac 0.91±0.09abcd 153.144＜0.001組別健康組單純模型組速效救心丸組速效救心丸+奧替普拉組奧替普拉組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 Bax/β-actin 0.21±0.05 0.34±0.03a 0.28±0.04ab 0.32±0.06ac 0.44±0.05abcd 32.072＜0.001 Bcl-2/β-actin 0.83±0.06 0.36±0.05a 0.68±0.07ab 0.38±0.06ac 0.25±0.04abcd 183.488＜0.001

3 討論

冠心病主要以脂質(zhì)沉淀、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生等為病理特征的慢性疾病，病人病情加重可發(fā)展為心肌梗死，其中脂質(zhì)代謝異常以及過(guò)度炎癥反應(yīng)貫穿于冠心病發(fā)展整個(gè)過(guò)程［7］。本研究構(gòu)建冠心病模型發(fā)現(xiàn)，大鼠ST段升高，血清中三酰甘油、總膽固醇水平明顯升高，HDL降低，提示大鼠出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈痙攣發(fā)生心肌缺血，且血脂水平代謝異常。TNF-α可介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)，一定程度上可反映動(dòng)脈粥樣硬化程度［8］。MCP-1可調(diào)控單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞遷移至斑塊，造成斑塊的不穩(wěn)定性。炎癥反應(yīng)與內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷有關(guān)，內(nèi)皮功能損傷后造成炎癥因子水平升高［9］，本研究發(fā)現(xiàn)模型大鼠TNF-α、MCP-1、ICAM-1、ET-1水平顯著升高，一氧化氮、PGI2水平降低，提示大鼠存在炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮功能不全。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單純模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)染色不均勻，細(xì)胞肥大，細(xì)胞核變形，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間隙變寬，心肌纖維排列紊亂，心肌纖維萎縮，表明模型大鼠發(fā)生嚴(yán)重心肌損傷、心肌炎癥反應(yīng)。以上均符合以往冠心病模型大鼠基本特征，提示模型復(fù)制成功。

速效救心丸中重要的中藥成分為冰片、川芎，藥理學(xué)研究顯示川芎具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠狀動(dòng)脈血流，改善心功能，抗氧化等功效；冰片具有消炎、鎮(zhèn)痛，降低心肌耗氧量等功效［10］。臨床研究顯示，速效救心丸對(duì)冠心病心血瘀阻證穩(wěn)定型心絞痛具有一定的改善作用，同時(shí)降低機(jī)體炎癥損傷［11］。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)速效救心丸能夠降低冠心病大鼠LDL，升高HDL，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［12］。本研究發(fā)現(xiàn)速效救心丸干預(yù)后可明顯降低模型大鼠三酰甘油、總膽固醇、TNF-α、MCP-1、ICAM-1、ET-1水平，升高HDL、一氧化氮、PGI2水平，組織學(xué)發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織損傷明顯得到緩解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，心肌細(xì)胞形態(tài)部分恢復(fù)正常，提示速效救心丸可平衡冠心病大鼠血脂水平，減輕內(nèi)皮功能損傷，緩解心肌組織損傷，關(guān)于其具體機(jī)制，目前尚不明確。

HIF-1α為缺氧反應(yīng)的重要調(diào)控因子，常規(guī)氧狀態(tài)下可通過(guò)泛素連接酶E3泛素化降低，維持細(xì)胞中較低水平的HIF-1α，低氧環(huán)境下則通過(guò)抑制E3水平的泛素進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞中HIF-1α水平。研究發(fā)現(xiàn)缺氧缺血狀態(tài)下心肌細(xì)胞損傷與冠心病、心臟手術(shù)病人不良預(yù)后有關(guān)［13］。基礎(chǔ)研究顯示下調(diào)HIF-1α表達(dá)可降低低氧條件誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。冠心病病人HIF-1α水平與病人心肌缺血程度有關(guān)，且HIF-1α可影響血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平。HIF-1α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制較復(fù)雜，目前多數(shù)認(rèn)為HIF-1α可能通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白發(fā)揮對(duì)缺氧細(xì)胞的凋亡作用［14］。BNIP3為Bcl-2家族BH3-only亞家族促凋亡蛋白，BNIP3為HIF-1α的目的基因，基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中，BNIP3為100個(gè)缺氧誘導(dǎo)基因中上調(diào)表達(dá)最為顯著的基因之一，提示其可能參與HIF-1α介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程［15］。本研究發(fā)現(xiàn)模型大鼠心肌組織中HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)明顯升高，心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)心肌組織中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低；而經(jīng)速效救心丸治療后HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)明顯降低，心肌細(xì)胞凋亡率也降低，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，推測(cè)速效救心丸誘導(dǎo)心肌凋亡的降低可能與其對(duì)HIF-1α/BNIP3通路的抑制有關(guān)。為驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究采用奧替普拉處理模型大鼠發(fā)現(xiàn)，經(jīng)奧替普拉處理后，大鼠心肌組織學(xué)損傷更嚴(yán)重，且血脂、炎性因子水平均顯著高于單純模型組，心肌組織中HIF-1α、BNIP3表達(dá)水平以及心肌組織細(xì)胞凋亡率均明顯高于單純模型組，提示HIF-1α過(guò)表達(dá)能夠加重冠心病大鼠炎癥反應(yīng)，擾亂血脂平衡，并進(jìn)一步破壞內(nèi)皮功能，加重心肌損傷。進(jìn)一步采用速效救心丸治療奧替普拉處理的模型大鼠，則能夠顯著緩解心肌組織及內(nèi)皮功能損傷，降低炎癥反應(yīng)，恢復(fù)血脂平衡，降低心肌細(xì)胞凋亡，提示速效救心丸能夠通過(guò)抑制HIF-1α/BNIP3通路的活化，調(diào)節(jié)冠心病的血脂水平、炎癥反應(yīng)，改善大鼠內(nèi)皮功能損傷、心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，速效救心丸能夠通過(guò)抑制HIF-1α/BNIP3信號(hào)通路活化，減輕冠心病炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮損傷，調(diào)節(jié)血脂平衡，減少心肌組織細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)冠心病大鼠的保護(hù)作用。速效救心丸的這一新發(fā)現(xiàn)可能為冠心病臨床治療提供新思路。然而冠心病的發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，速效救心丸是否可能通過(guò)HIF-1α/BNIP3信號(hào)通路下游其它途徑減輕心肌組織損傷，還有待后續(xù)深入研究。

（本文圖1，2見(jiàn)插圖6-1）

圖1 健康大鼠和冠心病大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色×100）：A為健康組；B為單純模型組；C為速效救心丸組；D為速效救心丸+奧替普拉組；E為奧替普拉組

圖2 健康大鼠和冠心病大鼠心肌組織凋亡情況（TUNEL法×100）：A為健康組；B為單純模型組；C為速效救心丸組；D為速效救心丸+奧替普拉組；E為奧替普拉組