蝦青素補(bǔ)充與急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體Nrf2抗氧化通路影響的研究

郭新明 吳麗君 趙靜 王僮

摘 要：目的：探究蝦青素及急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體抗氧化應(yīng)激通路的影響。方法：將32只7周齡雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后分為4組，分別為：對(duì)照組（C組），單純給藥組（M組），單純運(yùn)動(dòng)組（E組），運(yùn)動(dòng)加給藥組（EM組）。M、EM兩組以25 mg/kg/d的劑量灌胃蝦青素溶液4周，C、E兩組灌胃同體積大豆油。分組第1天大鼠進(jìn)行適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，分組后第20天進(jìn)行遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)測(cè)試，測(cè)得大鼠平均力竭速度為21 m/min（75%VO2max），第28天E、EM兩組進(jìn)行最終的一次性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)后即刻處死大鼠取血液及腓腸肌，分別測(cè)定各組大鼠血液中SOD、MDA和GSH水平，腓腸肌Akt、Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)水平以及p-Akt、Nrf2、HO-1的相對(duì)蛋白表達(dá)量（/β-actin）。結(jié)果：1）安靜狀態(tài)下，M組血清SOD活性高于C組、MDA含量低于C組（P<0.01）;分子水平上，M組HO-1的mRNA表達(dá)量明顯高于C組（P<0.05），p-Akt、HO-1相對(duì)表達(dá)量也顯著高于C組（P<0.01）。2）急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后即刻，E組SOD、MDA水平均顯著高于C組（P<0.01），GSH水平顯著低于C組（P<0.01）;E組Nrf2相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著低于C組（P<0.01）。EM組血清中MDA水平顯著低于E組（P<0.01），HO-1mRNA表達(dá)量顯著高于E組（P<0.05），p-Akt、Nrf2、HO-1相對(duì)蛋白表達(dá)量均顯著高于E組（P<0.05）。結(jié)論：急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激的同時(shí)，可明顯降低骨骼肌抗氧化通路關(guān)鍵蛋白Nrf2的相對(duì)蛋白表達(dá)，也對(duì)抗氧化酶具有刺激作用。蝦青素可激活急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌Akt、Nrf2表達(dá)，提高下游HO-1的表達(dá)量從而有效抑制大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

關(guān)鍵詞：蝦青素;急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng);Nrf2通路;氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)：G804.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-2076（2020）06-0111-08

Abstract： Objective： To investigate the effects of astaxanthin and acute high-intensity exercise on antioxidant stress pathways. Methods： After 5 days of adaptive feeding， 32 male SD rats aged 7 weeks were divided into 4 groups： control group （C）， simple administration group （M）， simple exercise group （E）， and exercise plus administration group （EM）. The M and EM groups were given astaxanthin solution at a dose of 25 mg/kg/d for 4 weeks， and the C and E groups were given the same volume of soybean oil. On the first day of the grouping， the rats were trained with adaptive exercise， and on the 20th day after the grouping， the rats were tested with increasing load. The average exhaustion speed of the rats was measured as 21m/min （75%VO2max）， and on the 28th day， the E and EM groups were given the final one-time high-intensity exercise. Immediately after exercise， the rats were sacrificed to take blood and gastrocnemius muscle， and the levels of SOD， MDA and GSH in the blood， mRNA expression levels of Akt， Nrf2 and Ho-1 in the gastrocnemius muscle， and relative protein expression levels （/β-actin） of P-Akt， Nrf2 and Ho-1 in the gastrocnemius muscle were determined. Results： In the quiet state， the activity of SOD in group M was higher than that in group C， and the content of MDA was lower than that in group C （P<0.01）; At the molecular level， the mRNA expression of HO-1 in group M was significantly higher than that in group C （P<0.05）， the relative expression levels of P-Akt and HO-1 were also significantly higher than those of group C （P<0.01）. The level of SOD and MDA in group E was significantly higher than that in group C （P<0.01）; GSH level was significantly lower than that of group C （P<0.01）; The relative protein expression of Nrf2 in group E was significantly lower than that in group C （P<0.01）. The serum MDA level in EM group was significantly lower than that in E group （P<0.01）; Ho-1 mRNA expression was significantly higher than that of group E （P<0.05）. The relative protein expression levels of p-Akt， Nrf2 and HO-1 were significantly higher than those of group E （P<0.05）. Conclusion： When acute high-intensity exercise causes the body to produce oxidative stress， it can significantly reduce the relative protein expression of Nrf2， a key protein in antioxidant pathway， and also has stimulation effect against oxidase. Astaxanthin can activate the expression of Akt and Nrf2 in skeletal muscle of rats with acute intense exercise， and increase the expression of HO-1 in the downstream， thus effectively inhibiting the oxidative stress caused by intense exercise.

Key words： astaxanthin; acute high-intensity exercise; Nrf2 pathway; oxidative stress

機(jī)體在正常新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定量自由基，其中約95%為氧自由基（ROS），它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)通?？杀豢寡趸烙到y(tǒng)清除[1]。但是，ROS超量產(chǎn)生、抗氧化體系過(guò)負(fù)荷將導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生生理病理?yè)p傷，被稱為氧化應(yīng)激[2]。目前，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和多種疾病的重要原因之一。疲勞運(yùn)動(dòng)及大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨骼肌細(xì)胞能量需求旺盛、代謝速率加快，機(jī)體缺氧及線粒體耗氧量增加導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生超量ROS[3]，因此這些運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激的原因之一。

蝦青素（Astaxanthin）是一種來(lái)自海洋生物的抗氧化劑[4-5]，其抗氧化活性是葉黃素、番茄紅素和β-胡蘿卜素等其他類胡蘿卜素的10倍，是α-生育酚的100倍[6]，具有延緩衰老、增強(qiáng)免疫力;調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心腦血管疾病;保護(hù)神經(jīng)、肝腎及抗腫瘤等多種作用。在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域，它具有抗氧化、改善機(jī)體物質(zhì)代謝、提高運(yùn)動(dòng)耐力、緩解運(yùn)動(dòng)疲勞等功效，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一[7]。

核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是機(jī)體抗氧化應(yīng)激通路的主要靶點(diǎn)，氧化應(yīng)激發(fā)生后，Nrf2被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核并與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，以啟動(dòng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白質(zhì)的后續(xù)表達(dá)[8-10]。近年來(lái)，在運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域有學(xué)者針對(duì)抗氧化與Nrf2相關(guān)通路展開(kāi)了研究，但研究結(jié)果并不豐富。

天然抗氧化劑蝦青素應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化妝品及養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域的研究已有廣泛報(bào)道，但在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域其對(duì)運(yùn)動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生抗氧化作用的分子機(jī)制仍不十分清晰。因此，本研究采用急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，探討蝦青素對(duì)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激保護(hù)的相關(guān)分子機(jī)制，以期為蝦青素在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選用7周齡體重180～200 g雄性SD大鼠32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為：對(duì)照組（C組），單純給藥組（M組），單純運(yùn)動(dòng)組（E組），運(yùn)動(dòng)加給藥組（EM組）。

1.2 藥物干預(yù)及運(yùn)動(dòng)方案

喂藥方案：M組、EM組連續(xù)灌胃含天然蝦青素豆油28天，蝦青素含量為25 mg/kg/d[11]（蝦青素購(gòu)于湖北雅仕達(dá)生物技術(shù)有限公司），C組、E組灌胃相同體積豆油作為對(duì)照。

運(yùn)動(dòng)方案：大鼠在具有電刺激功能的三跑道大鼠跑臺(tái)上進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。分組后第1天，E組、EM組大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為3 m/min運(yùn)動(dòng)5 min的適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)。一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度預(yù)適應(yīng)，適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)方案為以初始速度3 m/min運(yùn)動(dòng)3 min，間隔一分鐘后速度增加3 m/min，依次遞增，直至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)為大鼠受電擊后跑動(dòng)，三秒內(nèi)腹部貼地回到跑臺(tái)最后端，重復(fù)5次[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一周再次進(jìn)行遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)測(cè)試，得到大鼠平均力竭速度為21 m/min（75%VO2max）[13]。休息7天后，E、EM兩組進(jìn)行最終的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)。根據(jù)遞增負(fù)荷測(cè)試結(jié)果，把E組、EM組大鼠最終跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)方案確定為：跑臺(tái)坡度為-10°，速度為24 m/min，每組運(yùn)動(dòng)時(shí)間為5 min，每組間歇1 min，每只大鼠運(yùn)動(dòng)8組[14]。

1.3 樣本采集及保存

大鼠飼養(yǎng)4周稱重后，C、M兩組斷頭處死股動(dòng)脈取血、剝離腓腸肌;E、EM兩組大鼠運(yùn)動(dòng)后即刻進(jìn)行同樣樣本采集。剝離出的腓腸肌經(jīng)生理鹽水清洗后分裝，置于液氮迅速冷凍，之后放入-80℃冰箱保存待測(cè)。真空采血管從大鼠股動(dòng)脈取血3～5 ml，室溫靜置3 min，3000 rpm離心15 min，分離血清后分裝并保存于-80℃冰箱待測(cè)。

1.4 試劑及檢測(cè)方法

1.4.1 試劑

丙二醛（MDA）試劑盒;超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒;RNA提取試劑盒（Transzol up）;cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒;Tip Green qPCR Super Mix;小鼠單抗β-actin（42KD）1∶500;兔多抗Nrf2（C-20）（100KD）1∶500;小鼠單抗AKT-Phospho-S473（60KD）1∶4000;兔多抗HO-1/HMOX1（33KD）1∶1000。

1.4.2 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)量

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，再擴(kuò)增進(jìn)行RT-PCR，所用引物如表1。

1.4.3 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取150 mg大鼠腓腸肌勻漿后加入裂解液充分裂解后進(jìn)行離心（4℃下12 000 rpm離心5 min），取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-20℃保存。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行濃度定量。

以40 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉過(guò)夜后轉(zhuǎn)入PVDF膜上。加Nrf2抗體（1∶500）、p-Akt抗體（1∶1000）及HO-1抗體（1∶4000）、β-actin抗體（1∶500）4 ℃孵育過(guò)夜。加羊抗鼠IgG-Biotin（1∶1000）孵育50 min，經(jīng)PBST 洗膜后加ECL化學(xué)發(fā)光底物于膜上，5 min后置于轉(zhuǎn)移膜上進(jìn)行曝光、顯影、定影，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)FLK-1或BFGF與β-actin蛋白條帶的灰度掃描并用比值表示。

進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜（電流14 V，100 Ma，轉(zhuǎn)印2 h）、封閉過(guò)夜后轉(zhuǎn)入PVDF膜上。加FLK-1、BFGF抗體（均為1∶1000）、β-actin抗體（1∶500）4 ℃孵育過(guò)夜。加羊抗鼠IgG-Biotin（1∶5000）孵育2 h，經(jīng)PBST 洗膜后加ECL化學(xué)發(fā)光底物于膜上，5 min后置于轉(zhuǎn)移膜上，用X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，采用IPP分析膠片灰度值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間差異使用單因素方差分析（One way ANOVA）方法進(jìn)行檢驗(yàn)，用LSD方法檢驗(yàn)方差齊性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的圖表使用Microsoft Excel、SPASS24.0以及Graphpad prism6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠血液氧化應(yīng)激水平的變化

安靜狀態(tài)下，與C組相比M組SOD活性顯著升高（P<0.01，表2，圖1a），MDA含量顯著降低（P<0.01，表2，圖1b），GSH水平無(wú)明顯變化（表2，圖1c）。說(shuō)明安靜狀態(tài)下，蝦青素補(bǔ)充可提高血清中抗氧化酶SOD活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化。運(yùn)動(dòng)后即刻，E組血清SOD酶活性及MDA含量均顯著高于C組（P<0.01，表2，圖1a、1b）， GSH活性顯著低于C組（P<0.01，表2，圖1c）， 表明急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血清SOD、GSH及MDA都有顯著影響，可提高SOD酶活性、消耗GSH并導(dǎo)致氧化應(yīng)激。運(yùn)動(dòng)后即刻，EM組大鼠血清中MDA含量顯著低于E組（P<0.01，表2，圖1b）?？梢?jiàn)，中等劑量補(bǔ)充蝦青素4周可以明顯緩解急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化。

2.2 各組大鼠腓腸肌RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠腓腸肌細(xì)胞RT- PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。與C組相比，M、E兩組Akt及Nrf2表達(dá)量均無(wú)顯著性差異（圖2a，2b），但M組HO-1基因表達(dá)量顯著升高（P<0.05，圖2c）。與E組相比，EM組HO-1相對(duì)基因表達(dá)量也顯著升高（P<0.05，圖2c）。這表明補(bǔ)充蝦青素可促進(jìn)大鼠腓腸肌中抗氧化酶HO-1基因表達(dá)。

2.3 各組大鼠腓腸肌Western Blot檢測(cè)結(jié)果

對(duì)大鼠腓腸肌蛋白進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，安靜狀態(tài)下M組大鼠腓腸肌Akt磷酸化水平極顯著高于C組（P<0.01）;急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后E組大鼠腓腸肌Akt磷酸化水平降低但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平;與E組相比，EM組Akt磷酸化水平顯著升高（P<0.05）。這表明補(bǔ)充蝦青素可提高安靜狀態(tài)下及運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌中Akt的磷酸化水平（圖3b）。

M組大鼠腓腸肌中Nrf2相對(duì)蛋白表達(dá)量與C組相比略有升高，但差異不顯著;E組大鼠在運(yùn)動(dòng)后即刻腓腸肌中Nrf2相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著下降（P<0.01）;EM組大鼠腓腸肌中Nrf2相對(duì)蛋白表達(dá)與E組相比顯著升高（P<0.05）?？梢?jiàn)，急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可降低大鼠腓腸肌Nrf2相對(duì)蛋白表達(dá)量，而補(bǔ)充蝦青素則可以明顯提高急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌中Nrf2蛋白表達(dá)水平（圖3c）。

M組大鼠腓腸肌中HO-1蛋白表達(dá)量高于C組，差異非常顯著（P<0.01）;E組大鼠腓腸肌中HO-1蛋白表達(dá)量相比于C組有所降低，但差異不顯著;EM組大鼠腓腸肌中HO-1蛋白表達(dá)量顯著高于E組（P<0.05）。這表明補(bǔ)充蝦青素可提高安靜狀態(tài)下及運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌中HO-1蛋白表達(dá)（圖3d）。

3 分析與討論

3.1 急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠機(jī)體抗氧化機(jī)能的影響

研究表明，急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使骨骼肌內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，破壞了其氧化還原平衡從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)生[15-16]。

SOD被譽(yù)為機(jī)體抗氧化的第一道防線，可催化兩分子超氧陰離子（-O2）歧化為過(guò)氧化氫（H2O2）和氧氣（O2），從而使超氧陰離子的危害性大大降低[17]。SOD的活性越高，機(jī)體抗氧化能力越強(qiáng)。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)使機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基（ROS），ROS作為信號(hào)分子刺激SOD活性急劇升高，因此短時(shí)間內(nèi)SOD的活性隨ROS的增加而上升[18]。Nogueira等研究表明，大鼠連續(xù)30 min進(jìn)行80%VO2max運(yùn)動(dòng)后血液中SOD活性極顯著升高[19]。Roh等人的研究同樣顯示，健康男性進(jìn)行急性間歇性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，ROS水平及SOD活性極顯著升高[20]。本研究中，大鼠進(jìn)行急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后血清SOD活性極顯著高于C組，表明本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度引起機(jī)體發(fā)生強(qiáng)烈氧化應(yīng)激，刺激SOD活性增強(qiáng)。

丙二醛（MDA）是ROS引起的脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，MDA含量增多往往被視為是機(jī)體氧化應(yīng)激的標(biāo)志。急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的MDA水平升高主要發(fā)生在血液、骨骼肌和肝臟等器官和組織[21-22]。Lovlin等人最早發(fā)表關(guān)于MDA與運(yùn)動(dòng)引起ROS升高具有相關(guān)性的報(bào)道[23]。Sureda等人證實(shí)，成年女性自行車運(yùn)動(dòng)員高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)至力竭后，血液中MDA含量極顯著高于運(yùn)動(dòng)前[24]。同時(shí)也有研究證明，中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)降低大鼠血清MDA含量，而運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度大于70%VO2max時(shí)MDA水平顯著升高[25-26]。Quindry等人的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，并且他們發(fā)現(xiàn)并提出之前關(guān)于血液MDA含量與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度無(wú)關(guān)的研究可能是受限于當(dāng)時(shí)的檢測(cè)手段比較落后[27-28]。Belviranli等人的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一看法[18， 26， 29]。本研究中E組血清MDA含量顯著升高（P<0.01）再次說(shuō)明運(yùn)動(dòng)大鼠機(jī)體發(fā)生強(qiáng)烈氧化應(yīng)激。

谷胱甘肽（GSH）在抵抗脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尤其是對(duì)劇烈運(yùn)動(dòng)引起的脂質(zhì)過(guò)氧化。此外，GSH在體內(nèi)還有其他多種作用，如：氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，半胱氨酸的儲(chǔ)存和運(yùn)輸，細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，前列腺素代謝等[30]。有研究表明，ROS升高后需要消耗大量GSH來(lái)清除，因此急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起ROS上升導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激的同時(shí)往往伴隨著GSH含量降低，GSH氧化水平極顯著升高[31]。Altinoz等人的研究證明，大鼠進(jìn)行急性游泳運(yùn)動(dòng)后即刻血液中GSH含量顯著下降[29]。Kerksick的研究也表明，長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后即刻，血清中谷胱甘肽的總水平顯著上升，其中氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平顯著上升，GSH水平顯著下降[32]。本研究中，E組大鼠血清GSH含量顯著低于C組，說(shuō)明急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，體內(nèi)GSH大量消耗。

核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是表現(xiàn)機(jī)體抗氧化能力的轉(zhuǎn)錄因子。氧化應(yīng)激發(fā)生后，Nrf2被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核并與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，以啟動(dòng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白質(zhì)的后續(xù)表達(dá)。有研究表明，經(jīng)過(guò)4周強(qiáng)度為70%VO2max的有氧訓(xùn)練后，大鼠骨骼肌中Nrf2的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量顯著升高[33]，而一次性游泳至力竭的大鼠心肌中Nrf2蛋白表達(dá)量顯著降低[34]。還有研究表明，4周高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織中 Nrf2 、SOD、GSH-PX 和 CAT 的蛋白水平顯著升高，表明高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)可通過(guò)激活 Nrf2/ARE 信號(hào)通路來(lái)提高機(jī)體抗氧化能力并減弱氧化應(yīng)激損傷[35]。劉永敬等研究表明，Nrf2 敲除導(dǎo)致了大鼠骨骼肌中抗氧化酶的抑制及 ROS 的過(guò)量累積，從而造成了骨骼肌損傷并降低了運(yùn)動(dòng)能力;低氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)上調(diào) Nrf2 的表達(dá)，進(jìn)而激活 HIF-1α 及抗氧化酶活性，從而提高運(yùn)動(dòng)能力，并防止骨骼肌損傷[36]。本研究中，E組大鼠運(yùn)動(dòng)后即刻，骨骼肌中Nrf2/β-actin的相對(duì)蛋白表達(dá)量極顯著下降（P<0.01）。p-Akt以及HO-1的相對(duì)蛋白表達(dá)量和Akt、Nrf2及HO-1的mRNA表達(dá)量均未見(jiàn)顯著差異。說(shuō)明急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)Akt磷酸化、HO-1的蛋白表達(dá)量及Akt、Nrf2以及HO-1基因表達(dá)量影響并不顯著，主要對(duì)抗氧化通路關(guān)鍵蛋白Nrf2發(fā)生作用，可明顯降低其相對(duì)蛋白表達(dá)量，這可能是急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激的主要原因。

3.2 補(bǔ)充蝦青素對(duì)大鼠機(jī)體抗氧化機(jī)能的影響

蝦青素是一種葉黃素類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的抗氧化及抗炎活性[4， 37]。它可通過(guò)誘導(dǎo)超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá)以及淋巴細(xì)胞瘤-2基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)，在1-甲基- 4-苯基吡啶離子（MPP +）誘導(dǎo)的培養(yǎng)細(xì)胞中顯示出抗氧化和抗凋亡作用[38];還可以增加脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FAT / CD36）與肉堿-棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I（CPT I）的共定位，并阻止運(yùn)動(dòng)中CPT I的氧化修飾，更有利于脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)[39]。在6-羥基多巴胺處理的人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）中，蝦青素補(bǔ)充能顯著抑制細(xì)胞凋亡、線粒體異常和細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生[40]。

有研究表明，大鼠每天以≥ 20 mg/kg的劑量補(bǔ)充蝦青素，抵抗氧化應(yīng)激效果更為明顯，可以使安靜狀態(tài)下大鼠血漿中的SOD等抗氧化酶活性提高、MDA水平降低，但其作用機(jī)制尚不清楚[41-42]。補(bǔ)充蝦青素可以使處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下大鼠不同組織都產(chǎn)生相似變化即：SOD顯著增加，MDA顯著減少[43-45]。本研究中補(bǔ)充蝦青素組大鼠SOD酶活性極顯著高于對(duì)照組大鼠（P<0.01），MDA水平極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），與前人的研究結(jié)果一致。

有研究指出，安靜狀態(tài)下補(bǔ)充蝦青素是通過(guò)使機(jī)體產(chǎn)生少量ROS刺激SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶活性增高同時(shí)刺激細(xì)胞中Nrf2/ HO-1抗氧化系統(tǒng)，使Nrf2以及HO-1表達(dá)量上升[42]。Zhu等人的研究表明，補(bǔ)充抗氧化劑可通過(guò)PI3K- Akt通路激活Nrf2進(jìn)而發(fā)揮作用[46]。補(bǔ)充抗氧化劑17 β-estradiol （βE2）后，SD大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2的mRNA表達(dá)量以及蛋白活性顯著升高，同時(shí)顯著降低了ROS水平。然而，分別用PI3K- Akt特異性抑制劑LY294002或ICI182780進(jìn)行預(yù)處理，可顯著抑制βE2對(duì)于Nrf2的有益作用。Li等人的研究也表明，以上理論同樣適用于蝦青素，補(bǔ)充蝦青素有助于減少H2O2干預(yù)下細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，刺激Nrf2的表達(dá)，提高Nrf2與ARE的結(jié)合活性，并且在添加PI3K- Akt通路抑制劑后，Nrf2的表達(dá)量及活性顯著降低[47]。Li的研究也有類似結(jié)果，蝦青素對(duì)視網(wǎng)膜和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用隨Nrf2基因敲除而降低[48]。上述研究均表明抗氧化劑主要通過(guò)Nrf2發(fā)揮作用，而PI3K- Akt可能是調(diào)節(jié)Nrf2的主要途徑之一。

本研究中，M組相對(duì)于C組p-Akt相對(duì)蛋白表達(dá)量極顯著升高（P<0.01），Nrf2相對(duì)蛋白表達(dá)量有所上升，SOD活性顯著升高（P<0.01），HO-1mRNA表達(dá)量（P<0.05）及相對(duì)蛋白表達(dá)量均顯著上升（P<0.01），與前人的研究結(jié)果相類似，表明安靜狀態(tài)下補(bǔ)充蝦青素可以通過(guò)Akt信號(hào)通路激活Nrf2，從而提高下游抗氧化酶活性、提高機(jī)體抗氧化能力。

3.3 補(bǔ)充蝦青素對(duì)急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠機(jī)體抗氧化機(jī)能的影響

Fan等人研究表明，補(bǔ)充蝦青素可以提高急性運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌內(nèi)SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，同時(shí)降低MDA含量，從而抑制運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌損傷，且每日補(bǔ)充蝦青素量越大，對(duì)骨骼肌的保護(hù)作用越明顯[49]。Guo等人的研究表明，長(zhǎng)期補(bǔ)充蝦青素可以緩解運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的氧化應(yīng)激狀況，MDA含量顯著低于單純運(yùn)動(dòng)組、SOD活性增高[50]。Liu等研究表明，蝦青素補(bǔ)充與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練相結(jié)合的方式，可以明顯改善參加運(yùn)動(dòng)老年人肌肉的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)能力[51]。Aoi等研究表明，ASTA還可以在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中提高脂質(zhì)作為能量底物的利用率來(lái)緩解運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的疲勞[39]。不僅如此，補(bǔ)充蝦青素還可以減輕運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌和心肌損傷，減少運(yùn)動(dòng)引起的延遲性肌肉酸痛[52-53]。本研究中，EM組MDA水平顯著低于E組，表明補(bǔ)充蝦青素可以有效降低大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化。

有研究證明，連續(xù)6周每天補(bǔ)充蝦青素20 mg/kg，在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后即刻，補(bǔ)充蝦青素組大鼠心肌中Nrf2及HO-1的蛋白含量顯著高于單純運(yùn)動(dòng)組，心肌細(xì)胞凋亡顯著低于單純運(yùn)動(dòng)組[50]。說(shuō)明蝦青素可以作用于運(yùn)動(dòng)機(jī)體的Nrf2信號(hào)通路，提高其下游HO-1的表達(dá)，從而降低6周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的大鼠心肌過(guò)氧化和心肌細(xì)胞凋亡[50]。李鋒等研究表明補(bǔ)充蝦青素可以介導(dǎo)Nrf2通路，上調(diào)Nrf2、p-Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)，提高抗氧化酶SOD和T-AOC的活性，進(jìn)而緩解6周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的大鼠腎臟細(xì)胞氧化應(yīng)激和過(guò)度凋亡，保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)和功能正常[54]。本研究中EM組大鼠腓腸肌中HO-1的mRNA表達(dá)量顯著高于E組，且EM組大鼠p-Akt、Nrf2及HO-1的相對(duì)蛋白表達(dá)量（/β- actin）均顯著高于E組，說(shuō)明中等劑量補(bǔ)充蝦青素4周可激活骨骼肌Akt、Nrf2，提高下游抗氧化酶HO-1的表達(dá)量，顯著提高急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌的抗氧化能力。以上研究均表明蝦青素可作用于機(jī)體Nrf2信號(hào)通路，對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)機(jī)體的骨骼肌、心肌和腎臟等器官起到保護(hù)作用。

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